一、引言

二、材料與方法

（一）材料

1. 細胞
   人肝細胞系（如 HepG2 細胞），培養于含 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素的 DMEM 高糖培養基中，置于 37°C、5% CO?培養箱中培養。

2. 載體
   構建好的核糖體打靶載體，帶有綠色熒光蛋白（GFP）報告基因，用于監測轉染效率。

3. 電轉染設備
   電轉儀（型號 [具體型號]），配備不同規格的電轉杯。

4. 其他試劑
   電轉染緩沖液（如 Opti - MEM）、胰蛋白酶、臺盼藍等。

（二）實驗方法

1. 細胞準備
   （1）將 HepG2 細胞接種于不同規格的培養皿中，設置不同的初始細胞密度（如 1×10?、2×10?、5×10?個 / 皿），培養至不同的匯合度（如 50%、70%、90%）。
   （2）用胰蛋白酶消化細胞，收集細胞，用 PBS 洗滌兩次，然后重懸于不同的電轉染緩沖液中，調整細胞濃度至合適范圍（如 1×10? - 1×10?個 /mL）。

2. 電轉染參數設置
   （1）設置不同的電壓值（如 100V、200V、300V）、脈沖時間（如 5ms、10ms、20ms）和脈沖次數（如 1 次、2 次、3 次），采用不同規格的電轉杯（如 0.2cm、0.4cm 電轉杯）。
   （2）將重懸后的細胞與核糖體打靶載體混合（載體用量根據前期預實驗確定），加入電轉杯中，按照設定的電轉染參數進行電轉染。

3. 轉染后處理
   電轉染后的細胞立即轉移至預熱的完整培養基中，置于 37°C、5% CO?培養箱中繼續培養。在不同時間點（如 24 小時、48 小時、72 小時）觀察細胞狀態，并用熒光顯微鏡檢測 GFP 陽性細胞比例以評估轉染效率，同時采用臺盼藍拒染法檢測細胞存活率。

三、結果

（一）細胞密度和匯合度對轉染效率和存活率的影響

（二）電轉染參數的影響

1. 電壓
   在電壓為 200V 時，轉染效率達到峰值，而過高的電壓（如 300V）會導致細胞大量死亡，轉染效率反而降低。這表明合適的電壓對于維持細胞完整性和促進載體進入細胞至關重要。

2. 脈沖時間和脈沖次數
   脈沖時間為 10ms、脈沖次數為 2 次時，轉染效果較好。較短的脈沖時間可能無法使載體充分進入細胞，而過長的脈沖時間或過多的脈沖次數會對細胞造成不可逆的損傷。

3. 電轉杯規格
   0.2cm 電轉杯在本實驗條件下表現出更好的轉染效率，可能是由于其更適合小體積的細胞 - 載體混合液，能夠更均勻地分布電場。

（三）緩沖液和溫度的影響

1. 緩沖液
   Opti - MEM 緩沖液相比其他常用緩沖液，能顯著提高轉染效率和細胞存活率。其特殊的成分可能有助于維持細胞在電轉染過程中的生理狀態。

2. 溫度
   在電轉染過程中，保持電轉杯和細胞 - 載體混合液在室溫（25°C）時的轉染效果優于在低溫（4°C）或高溫（37°C）條件下。室溫可能有利于電場與細胞的相互作用，減少溫度對細胞的應激損傷。

四、討論

（一）細胞狀態的重要性

（二）電轉染參數的優化機制

1. 電壓與細胞膜通透性
   電壓是影響電轉染的關鍵參數之一。合適的電壓能夠使細胞膜暫時形成可逆性的小孔，允許載體進入細胞。當電壓過高時，細胞膜會受到嚴重破壞，導致細胞死亡和內容物泄漏，從而降低轉染效率。這種細胞膜通透性的改變是一個復雜的物理過程，與細胞膜的脂質雙分子層結構和電場強度密切相關。

2. 脈沖時間和脈沖次數與載體進入細胞的效率
   脈沖時間和脈沖次數協同作用影響載體進入細胞的效率。適當延長脈沖時間和增加脈沖次數可以增加載體進入細胞的機會，但過度的操作會對細胞造成累積性損傷。這可能是由于長時間或多次的脈沖會引起細胞膜的過度穿孔和細胞內環境的紊亂，影響細胞的正常代謝和功能。

3. 電轉杯規格與電場分布
   電轉杯的規格影響電場在細胞 - 載體混合液中的分布。較小規格的電轉杯能夠產生更均勻、更強的電場，使每個細胞受到更一致的電刺激，有利于載體均勻地進入細胞。而較大規格的電轉杯可能導致電場分布不均勻，部分細胞受到過高或過低的電場強度，影響轉染效率。

（三）緩沖液和溫度對轉染的影響

1. 緩沖液成分與細胞保護
   Opti - MEM 緩沖液中的成分可能對細胞在電轉染過程中起到保護作用。它可能含有一些能夠穩定細胞膜、調節細胞內離子濃度的物質，減少電轉染對細胞的損傷。此外，緩沖液的滲透壓等物理性質也會影響細胞的生理狀態，進而影響轉染效率。

2. 溫度與細胞應激反應
   溫度在電轉染過程中對細胞的應激反應有顯著影響。室溫條件下，細胞的生理活性和細胞膜的穩定性處于一個相對平衡的狀態，有利于電轉染的進行。低溫可能會使細胞膜變得僵硬，降低其對電場的響應性，而高溫則可能加速細胞的代謝和應激反應，使細胞更容易受到電轉染損傷。

五、結論