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慢性糖尿病傷口主要由感染、炎癥和血管生成相關疾病引起。治療慢性糖尿病傷口的理想方法是結合抗感染策略、免疫微環境調節和促進血管生成。血管內皮生長因子（VEGF）可以促進血管內皮細胞的增殖和遷移，從而促進血管生成。然而，其穩定性低，不能靶向病灶，限制了其應用。多形核中性粒細胞衍生外泌體（PMNExo）具有良好的遞送特性，可用于VEGF的治療遞送，此外，它們還保留了多形核中性粒細胞（PMN）的抗菌能力。然而，低PMNExo生成阻礙了其治療應用。本文作者Yanzhen Yu等采用了擠壓法制備了PMNs外泌體模擬物（EM），成功在Journal of Nanobiotechnology上發表篇名為An injectable, activated neutrophil-derived exosome mimetics/extracellular matrix hybrid hydrogel with antibacterial activity and wound healing promotion effect for diabetic wound therapy的研究成果，將VEGF封裝的活化中性粒細胞外泌體模擬物（aPMNEM）裝入ECM，以開發用于治療慢性傷口的VEGF-aPMNEM-ECM混合水凝膠。下面小編帶大家了解一下本文的主要研究成果。
01：VEGF-aPMNEM-ECM混合水凝膠的制備與表征
在本研究中，作者將VEGF封裝的活化中性粒細胞外泌體模擬物（aPMNEM）裝入ECM，以開發用于治療慢性傷口的VEGF-aPMNEM-ECM。首先對納米材料進行合成，而后驗證aPMNEM的質量，作者使用了TEM，Western blotting, NTA和Zeta電位測量進行了表征。TEM和NTA結果顯示，aPMNEM的直徑約為160nm，與PMNExo、aPMNExo和PMNEM的大小相似。Zeta電位測量顯示，aPMNEM的電位約為-40 mV，與PMNExo、aPMNExo和PMNEM的表面膜電位相似。為了量化aPMNEM的產量，作者測量了由相同數量的細胞通過NTA產生的PMNExo、aPMNExo、PMNEM和aPMNEM的數量。NTA顯示，通過多層過濾擠出生產的aPMNEM產量約為aPMNExo產量的10倍。接下來，為了研究aPMNEM的質量，作者進行了4D無標記定量蛋白質組學分析，并通過主成分分析（PCA）、火山圖分析和熱圖分析比較了aPMNEM和PMNExo的蛋白質含量。PCA顯示aPMNEM和PMNExo蛋白含量不同。此外，蛋白質組學分析發現，與PMNExo相比，aPMNEM中有1807種不同的蛋白質類型具有顯著差異。與PMNExo相比，aPMNEM中差異表達的蛋白中有1501個蛋白上調（折疊變化>2），306個蛋白下調（折疊變化>2）。GO注釋分析顯示aPMNEM與PMNExo具有相似的生物過程、細胞成分和分子功能。在殺菌相關蛋白中，中性粒細胞明膠酶相關脂鈣蛋白（LCN2）、溶菌酶（LYZ）和肽聚糖識別蛋白（PGLYRP1）上調，而補體C3（C3）、髓過氧化物酶（MPO）和補體C4-B（C4B）在PMNEM中與PMNExo相比下調。最后作者通過物理冷凍結合SDS-Triton洗脫法制備了溫度敏感的ECM水凝膠。
02：aPMNEM分子清創
作者通過4D無標記定量蛋白質組學進行分析，分析其蛋白質含量來確定aPMNEM的組成。結果顯示，aPMNEM含有3386個蛋白，通過分子功能分析發現，這些蛋白參與了氧化還原酶的活性，這可能是aPMNEM具有抗菌活性的原因之一。而后為了驗證aPMNEM的抑菌能力，作者首先在體外研究了aPMNEM對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的菌落生長抑制作用。研究結果表明，aPMNEM處理3小時可有效抑制體外培養的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，破壞細菌細胞壁結構。隨后，用aPMNEM治療大腸桿菌和金黃色葡萄球菌感染的大鼠傷口。組織的Giemsa結果顯示，aPMNEM成功地抑制了細菌在體內的生長，這與aPMNEM體外抑菌試驗的結果相吻合。為了評估aPMNEM的抗炎作用，作者測定了對照組和aPMNEM組感染創面和血漿中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β和IL-6水平在24和48 h時的變化。qPCR結果顯示，對照組和aPMNEM組感染創面中炎癥因子水平在24 h時無顯著變化。
03：VEGF-aPMNM - ECM對體內重要器官的影響及生物分布
為了驗證VEGF-aPMNM-ECM的生物相容性，作者通過H&E染色法觀察這些器官的生理結構變化。結果顯示，與PBS處理的對照組相比，VEGF-aPMNM-ECM對SD大鼠全層皮膚創面模型無明顯的病理改變，說明VEGF-aPMNM-ECM對SD大鼠全層皮膚創面模型無毒性作用。同時使用了小動物體內成像驗證VEGF - aPMNEM在創面的生物分布，顯示出aPMNEM在傷口部位保持48小時的功能，并且不隨時間擴散。
04：VEGF-aPMNEM-ECM在皮膚傷口愈合中的體內體外應用能力探究
作者建立大鼠全層皮膚創面模型，并給予多種治療。結果顯示，與其他治療方法相比，VEGF-aPMNEM-ECM治療可能更能促進創面愈合。治療14天后取出創面組織，進行H&E和Masson染色、免疫組化分析和免疫熒光（IF）分析。H&E染色結果證實，四組中VEGF-aPMNEM-ECM處理傷口邊緣最短，上皮化程度最高。Masson染色結果顯示，與其他三組相比，VEGF-aPMNEM-ECM組傷口部位膠原沉積最多，膠原排列更有序。通過CD31和α-SMA抗體的免疫組化和IF 分析，VEGF-aPMNEM-ECM治療組血管數量最多，其次是ECM和aPMNEM-ECM治療組，PBS治療組血管數量較少。這些結果表明VEGF-aPMNEM-ECM通過促進血管生成來促進皮膚傷口愈合。為了證實VEGF-aPMNEM-ECM對內皮細胞血管生成的治療潛力，作者使用VEGF-aPMNEM-ECM進行了血管形成實驗。結果表明，VEGF-aPMNEM-ECM促進了血管內皮細胞向血管的轉化，VEGF-aPMNEM-ECM組血管總長度和支管長度最長。
VEGF-aPMNEM-ECM在皮膚傷口愈合中的體內體外應用能力探究
05：VEGF-aPMNEM-ECM對炎癥微環境的體內調節作用
VEG為了確定ECM的組成，作者通過進行4D無標記定量蛋白質組學分析來分析ECM的蛋白質含量。在ECM水凝膠中共發現112種蛋白質。生物信息學研究揭示了ECM與“細胞外成分”之間的相關性。根據以往的研究，那些數量較多的蛋白，如膠原I，可使M1巨噬細胞轉化為M2巨噬細胞。CD86 (M1巨噬細胞表面標記物)和CD206 (M2巨噬細胞表面標記物)抗體IF分析結果證實，ECM、aPMNEM - ECM和VEGF-aPMNEM-ECM治療組顯著誘導M1巨噬細胞向M2巨噬細胞轉化；但三組間無明顯差異。
綜合實驗結果我們不難看出，此研究成功開發了一種新型的VEGF-aPMNEM-ECM生物材料，用于治療慢性糖尿病傷口。該材料利用PMN衍生的外泌體模擬物作為載體，保護VEGF免受降解，并通過ECM水凝膠延長其在傷口部位的駐留時間，且在促進傷口愈合方面顯示出良好的生物相容性和生物安全性。作者團隊研究開發的VEGF-aPMNEM-ECM納米材料為糖尿病創傷治療提供了一個有前景的平臺，通過在aPMNEM-ECM中加載各種可用的細胞因子，有潛力應用于不同疾病的治療，為糖尿病傷口治療提供了新的策略。
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