在針對(duì)新樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)的過(guò)程中，面對(duì)有色樣品時(shí)，許多用戶往往認(rèn)為濁度檢測(cè)試劑是唯-一的選擇，但事實(shí)真的如此嗎？

一、認(rèn)識(shí)你的敵人：深入了解細(xì)菌內(nèi)毒素

細(xì)菌內(nèi)毒素?zé)o疑是令人頭疼的存在，作為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)普遍存在的非感染性微粒，它能夠觸發(fā)免疫反應(yīng)，引發(fā)發(fā)熱、炎癥乃至膿毒性休克等嚴(yán)重后果，極-端情況下甚至可致命。鑒于此，藥品和保健品若遭內(nèi)毒素污染，將帶來(lái)極大的安全隱患。因此，實(shí)施嚴(yán)格的內(nèi)部細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)計(jì)劃，對(duì)于確保這些產(chǎn)品以及醫(yī)療器械免受內(nèi)毒素污染至關(guān)重要。BET（細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)）不僅是一項(xiàng)監(jiān)管要求，更是維護(hù)公眾健康不-可-或-缺的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

圖1. 革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)示意圖

二、出于對(duì)顏色的好奇：顯色法檢測(cè)背后的科學(xué)

您是否曾好奇動(dòng)力學(xué)顯色試驗(yàn)的奧秘？這項(xiàng)藥典技術(shù)背后隱藏著令人驚嘆的科學(xué)原理。

圖 2. LAL級(jí)聯(lián)機(jī)制描述和動(dòng)力學(xué)顯色試驗(yàn)的方法原理

顯色試驗(yàn)之所以神奇，在于其結(jié)合了簡(jiǎn)便性、線性度和準(zhǔn)確性。試驗(yàn)中，除了利用級(jí)聯(lián)機(jī)制中的LAL酶（包括因子C、因子B和凝血酶原）外，還引入了顯色底物這一關(guān)鍵元素。最初，顯色底物呈無(wú)色狀態(tài)，但當(dāng)它與被細(xì)菌內(nèi)毒素活化的凝血酶相遇時(shí)，一場(chǎng)化學(xué)反應(yīng)悄然發(fā)生。

圖3.ACC 顯色試劑中使用的顯色底物示例

凝血酶會(huì)裂解精氨酸-發(fā)色基質(zhì)中的CO鍵，釋放出一種叫做對(duì)硝基苯胺（pNA）的發(fā)色團(tuán)——一種能吸收光（最大吸收值接近405nm的可見(jiàn)光）的微粒，從而引發(fā)溶液顏色變黃，這一變化肉眼可見(jiàn)。

為了精確測(cè)量這一顏色變化，科學(xué)家們采用吸收光分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析。根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)，顏色的深淺程度與樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量成正比。因此，通過(guò)顯色試驗(yàn)，我們能夠快速、準(zhǔn)確地評(píng)估樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素水平。

圖4. 在405nm 波長(zhǎng)處測(cè)量的吸光度與內(nèi)毒素濃度定義的典型示意圖

自20世紀(jì)90年代以來(lái)，顯色檢測(cè)技術(shù)憑借其獨(dú)-特的優(yōu)勢(shì)，改變了細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)領(lǐng)域的游戲規(guī)則，成為生物學(xué)與比色法完-美結(jié)合的典-范。

三、重組顯色測(cè)試如何進(jìn)一步提高產(chǎn)出？

重組顯色檢測(cè)法通過(guò)引入幾項(xiàng)突破性功能，將其優(yōu)勢(shì)提升到了新的高度。

圖5. 一個(gè)典型的微孔板顯示了動(dòng)力學(xué)顯色試驗(yàn)的顏色變化

首先，重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR）PyroSmart NextGen®采用了重組因子C、重組因子B和重組凝固酶原，這些因子是從美洲鱟（Limulus polyphemus）中基因克隆并表達(dá)的級(jí)聯(lián)酶制劑，這一變革使得檢測(cè)過(guò)程中無(wú)需再使用動(dòng)物源成分，從而實(shí)現(xiàn)了更加環(huán)保的檢測(cè)方式。

圖6. 重組級(jí)聯(lián)試劑的作用機(jī)制

此外，PyroSmart NextGen®試劑中不含動(dòng)物源LAL試劑中的原生成分因子G，這一改進(jìn)避免了因(1→3)-β-D-葡聚糖（一種常見(jiàn)污染物）引發(fā)的共敏性問(wèn)題，進(jìn)而顯著降低了檢測(cè)結(jié)果超范圍的風(fēng)險(xiǎn)。

圖7. 含有和不含(1→3)-β-D-葡聚糖加標(biāo)的兩個(gè)RSE標(biāo)準(zhǔn)系列的起始時(shí)間（秒）的線性回歸

圖8.使用六種不同批次的PyroSmart NextGen®的RSE標(biāo)準(zhǔn)曲線系列，顯示出很強(qiáng)的批次一致性

尤為重要的是，該試劑確保了批次間結(jié)果的高度可重復(fù)性，這一特性為質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和現(xiàn)代化，特別是推動(dòng)移液自動(dòng)化進(jìn)程，奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

在ACC(Associates Of Cape Cod)，PyroSmart NextGen®于相同的cGMP條件下生產(chǎn)，保證了其質(zhì)量和性能的一致性和可靠性。與此同時(shí)，rCR與我們已獲得FDA許可的LAL試劑一樣，均在通過(guò)ISO 14385認(rèn)證的工廠生產(chǎn)，這不僅確保了檢測(cè)結(jié)果的可靠與可重復(fù)，也使rCR成為細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)領(lǐng)域中一個(gè)值得信賴且可持續(xù)的解決方案。

四、揭開(kāi)秘密：有色樣品檢測(cè)背后的數(shù)據(jù)

有一種常見(jiàn)的誤解，認(rèn)為顯色法在處理有色樣品時(shí)會(huì)遇到困難。然而，通過(guò)實(shí)際數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)證明，當(dāng)方法適用性良好時(shí)，顯色法，包括重組顯色法，能夠高效且準(zhǔn)確地檢測(cè)有色樣品。根據(jù)USP<85>和<1085>的規(guī)定，對(duì)所有樣品進(jìn)行方法適用性測(cè)試是常規(guī)測(cè)試前的必要步驟，這有助于確定適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法，并評(píng)估檢測(cè)設(shè)置（如試劑類型、方法類型和儀器）與樣品的兼容性。

趣聞1：大多數(shù)藥物樣本類型都會(huì)干擾BET。

趣聞2：絕大多數(shù)樣品干擾都可以通過(guò)簡(jiǎn)單的BET檢查用水稀釋［如LAL試劑水(LRW)］來(lái)克服。

有色樣品也不例外。除了固有的顏色外，它們通常還可能含有干擾測(cè)試的成分。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，用LRW（如無(wú)熱原水）稀釋極有可能在一個(gè)簡(jiǎn)單的步驟中解決光學(xué)和化學(xué)干擾這問(wèn)題。

除了稀釋外，還有另一個(gè)非常有價(jià)值的工具：儀器和軟件。先進(jìn)分光光度法的出現(xiàn)大大緩解了人們對(duì)測(cè)試有色樣品的擔(dān)憂。基線設(shè)置和歸零在此過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。例如，在Pyros Kinetix® Flex試管閱讀器中，每個(gè)孔都要單獨(dú)計(jì)時(shí)和評(píng)估，它涉及記錄樣品的初始吸光度。這基本上是在任何反應(yīng)發(fā)生之前通過(guò)樣品的固有顏色來(lái)測(cè)量吸光度。然后將此基線讀數(shù)用作所有一系列稀釋中（不超過(guò)最大有效稀釋度）后續(xù)10秒測(cè)量的參考點(diǎn)，從而可以準(zhǔn)確捕獲真實(shí)的顏色強(qiáng)度增加，而與樣品本身的顏色無(wú)關(guān)。

Pyros Kinetix® Flex由Pyros® eXpress軟件提供支持，該軟件內(nèi)置了每孔檢索原始數(shù)據(jù)的規(guī)范。在初始?xì)w零期間，在405nm波長(zhǎng)處吸收強(qiáng)烈顏色的樣品會(huì)產(chǎn)生較低的透射率值，因此會(huì)在軟件中標(biāo)記為超出范圍，提醒操作員采取進(jìn)一步措施。

五、案例研究：顯色法在有色樣品測(cè)試中的實(shí)際應(yīng)用

那么，這一切是如何實(shí)現(xiàn)的呢？讓我們來(lái)看看MIC注射劑的可比性測(cè)試——一種維生素混合注射劑，由主要化合物（蛋氨酸、肌醇、膽堿）和其他成分（如維生素B12）組成。根據(jù)各成分的濃度，最終制備可能如下所示：

圖9. MIC注射液的系列稀釋

1. LRW中的稀釋系列（MVD=14000）

2.  加入BET水后，有色背景會(huì)被進(jìn)一步稀釋

3. 使用動(dòng)態(tài)濁度法（KTA）測(cè)試MIC注射液所有測(cè)試系列稀釋的陽(yáng)性對(duì)照和陽(yáng)性樣品對(duì)照的數(shù)據(jù)收集圖（加標(biāo)濃度為0.5 EU/mL）：

圖10. 在Pyros Kinetix® Flex管式讀數(shù)器中進(jìn)行動(dòng)態(tài)濁度測(cè)試時(shí)，對(duì)添加了0.5EU/mL的MIC注射稀釋液的范圍進(jìn)行的數(shù)據(jù)采集圖

解釋：原液-未經(jīng)測(cè)試。濃縮的MIC注射液呈深黃色，能非特異性地吸收整個(gè)可見(jiàn)光光譜。

圖11. 使用動(dòng)態(tài)顯色法在Pyros Kinetix® Flex管式閱讀器上進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，對(duì)添加0.5EU/mL的注射稀釋液范圍所繪制的數(shù)據(jù)采集圖

（1）1:10的PPC - 固有顏色對(duì)于濁度測(cè)試來(lái)說(shuō)仍然太深，仍然會(huì)非特異性地吸收通過(guò)的光，Pyros® eXpress會(huì)在測(cè)試開(kāi)始60秒后通知用戶透射率規(guī)格未達(dá)標(biāo)。

（2）1:100的PPC - 在0到800秒之間會(huì)有殘余的光學(xué)干擾，然后會(huì)被與細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)有關(guān)的濁度變化所克服。

（3）1:1000的PPC - 無(wú)光學(xué)干擾。

（4）1:10000的PPC - 無(wú)光學(xué)干擾。

總之，濁度測(cè)試與顯色測(cè)試觀察到的光學(xué)干擾程度相同。在 1:100時(shí)觀察到殘余干擾。用兩種LAL方法檢測(cè)時(shí)，1:1000稀釋液都沒(méi)有光學(xué)和化學(xué)干擾，因此可以選擇1:1000稀釋液進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)和驗(yàn)證。

使用PyroSmart NextGen®進(jìn)行了其他測(cè)試，將MIC注射液按1:500稀釋，足以克服光學(xué)干擾。

六、專家意見(jiàn)：質(zhì)量控制技術(shù)人員參與其中

在制藥質(zhì)量控制領(lǐng)域，領(lǐng)-先的科學(xué)家和管理人員已成功驗(yàn)證了有色樣品的動(dòng)態(tài)顯色法測(cè)試。他們的實(shí)踐表明，根據(jù)具體情況，測(cè)試策略可靈活選擇：一些團(tuán)隊(duì)直接采用顯色技術(shù)，看重其寬動(dòng)態(tài)范圍的優(yōu)勢(shì)；有的則從濁度技術(shù)入手，逐步過(guò)渡到顯色技術(shù)；特別是對(duì)新產(chǎn)品的內(nèi)部測(cè)試，有些企業(yè)直接應(yīng)用重組顯色法來(lái)檢測(cè)有色樣品。

除了卓-越的分析性能，光度測(cè)定技術(shù)還積極響應(yīng)3R原則（減少、替代、回收），顯著降低了試劑中動(dòng)物源性原料的使用，而重組試劑更是摒棄了這類原料。

七、關(guān)于稀釋：獲得準(zhǔn)確結(jié)果的關(guān)鍵

在檢測(cè)過(guò)程中，正確的稀釋技術(shù)是確保有色及無(wú)色樣品獲得準(zhǔn)確結(jié)果的關(guān)鍵，有助于消除對(duì)顯色檢測(cè)能力的誤解。通過(guò)深入理解反應(yīng)成分，運(yùn)用合適的儀器和軟件平臺(tái)，并有效利用其內(nèi)置功能來(lái)標(biāo)識(shí)不合格樣品，用戶能在檢測(cè)初期迅速識(shí)別問(wèn)題。經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄩ_(kāi)發(fā)，顯色技術(shù)在有色樣品檢測(cè)上的表現(xiàn)與濁度技術(shù)相當(dāng)，甚至在低稀釋度下，重組顯色法也能驗(yàn)證結(jié)果的有效性，根據(jù)專家意見(jiàn)、經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)和對(duì)動(dòng)物福利的倫理要求，證明重組顯色法不受樣品顏色影響的穩(wěn)健性、可持續(xù)性和可靠性。

這些先進(jìn)方法的采用，標(biāo)志著藥品質(zhì)量控制向更加標(biāo)準(zhǔn)化和現(xiàn)代化的程序邁進(jìn)，不僅提升了檢測(cè)效率，還確保了醫(yī)療產(chǎn)品的安全性和有效性。