近日，中國科學(xué)院上海藥物研究所于International Journal of Pharmaceutics上發(fā)表題為“納米材料大小和濃度的關(guān)鍵參數(shù)以標準化納米顆粒跟蹤分析”的文章。該項研究中，作者系統(tǒng)性地評估了包括樣品構(gòu)成，樣品濃度，儀器設(shè)置參數(shù)，相機設(shè)置參數(shù)，液體流速對于NTA (NanoSight NS300) 測量準確性的影響。在研究過程中，他們同時選取了顆粒粒徑表征的金標準——透射電子顯微鏡及基于電阻脈沖感應(yīng) (RPS) 原理的NanoCoulter納米庫爾特粒度分析儀進行正交實驗，交叉驗證NTA對顆粒粒徑及濃度測量的精度。

比較不同顆粒濃度下測量結(jié)果的準確性

圖1樣品濃度對NTA測量結(jié)果的影響。

作者使用了不同大小的聚苯乙烯 (PS) 和二氧化硅 (SiO₂)標準顆粒，在不同的粒子濃度下進行了測量，并比較了不同濃度下的平均尺寸和濃度偏差。結(jié)果顯示，當(dāng)粒子濃度在10⁸-10⁹ particles/mL之間時，測量結(jié)果最為準確，線性趨勢最好。此時對應(yīng)視野內(nèi)的顆粒數(shù)為10-100和400-6500個。

比較不同曝光度對測量結(jié)果的影響

圖2. 曝光度對NTA測量結(jié)果的影響

與DLS不同，NTA通過相機追蹤顆粒的實時的布朗運動進行顆粒粒徑計算。因此優(yōu)化相機設(shè)置參數(shù)可以顯著提高NTA測得的粒徑和濃度的準確性。作者使用了混合的不同尺寸的PS顆粒，在不同的曝光度 (camera level) 下進行了表征。曝光度是表明相機對顆粒運動敏感程度的參數(shù)。通過調(diào)節(jié)曝光度，可以影響NTA的拍照結(jié)果。結(jié)果顯示，在曝光度為6-9時，100 nm的PS顆粒觀測不佳，而200 nm的PS顆粒清晰可見，當(dāng)曝光度為10-14時，100 nm的PS顆?？梢郧逦乇挥^測到，而200 nm的PS顆粒會過曝，影響結(jié)果。隨后作者進一步評估了曝光度對100 nm，120 nm，150 nm，170 nm和200 nm的PS顆粒的粒徑峰值及分布進行了表征。結(jié)果表明，曝光度變化并未顯著影響PS顆粒的粒徑峰值，但是隨著曝光度上升，各組PS顆粒的粒徑平均值上升。因此作者認為具體的不同大小的顆粒會與曝光度共同影響粒徑的測量結(jié)果。當(dāng)樣本分散度較大時，NTA相機難以找到合適的曝光度以保證可以拍到所有顆粒。在撰寫相關(guān)報告的時候，需要將NTA的曝光度等設(shè)定參數(shù)一并提交，以保證數(shù)據(jù)透明性。

比較不同不同泵速對測量結(jié)果的影響

之前的研究已經(jīng)表明，溶液粘度會影響NTA測量結(jié)果的準確性，但是對于泵速對測量結(jié)果有何影響仍是未知，因此作者使用了不同大小的PS顆粒，在不同的泵速下進行了測量，并比較了不同速度下的平均尺寸和濃度偏差。結(jié)果顯示，對于小于200 nm的顆粒，泵速在50 AU (arbitrary unit)以內(nèi)可以得到較為準確的結(jié)果，而對于更大的顆粒，則需要更低的泵速才能保證準確性。

圖4. NTA、DLS和RPS對多分散樣本的測量影響

隨后基于這些結(jié)果，作者按照該標準操作流程，評估了NTA對于多分散樣品的表征能力。作者制備了1: 1和10: 1（濃度比）的100 nm和150 nm PS顆?；旌衔?，根據(jù)不同的曝光度，NTA在7-10的范圍內(nèi)對兩個樣品都可以順利測量得出兩個粒徑峰位。隨后，作者進一步制備了1: 1: 1的100 nm，150 nm和200 nm及1: 1: 1: 1的100 nm，150 nm，170 nm和200 nm的三混合和四混合樣本，結(jié)果表明NTA無法完成測量，僅能得出一個寬峰。隨后作者進一步使用DLS和RPS對上述四個樣本進行分析，DLS對于上述四個樣本都無法測量得到精確峰位，僅能得到一個單峰，而基于RPS理論的NanoCoulter通過單顆粒檢測手段，成功地測量出混合物的粒徑，并得出精確峰位。隨后作者進一步驗證了RPS的粒徑測量效果，制備了濃度比為1: 1: 1: 1的80 nm，120 nm，160 nm和200 nm的混合物。測量結(jié)果再次證實RPS可以順利地將混合物測出對應(yīng)的峰，并且不同的樣品峰之間區(qū)分明顯，分辨率良好。這種四分布樣品可以更真實的代表實際樣品。

最后，作者選取了兩種外泌體（分別來源于HEK293細胞和干姜），分別使用NTA，DLS和RPS技術(shù)進行粒徑分析。結(jié)果表明在粒徑分析方面，NTA所得到的數(shù)據(jù)與TEM相似，而DLS粒徑值偏大，RPS所得粒徑結(jié)果偏小。在濃度方面，RPS表現(xiàn)出更精確的定量分析能力，這得益于RPS的單顆粒檢測技術(shù)，可以對每一個顆粒實現(xiàn)精確表征。

通過對實際樣品的測量，作者歸納總結(jié)了四種不同的顆粒表征方法的特點（表1）。作者認為NTA在顆粒粒徑分析方面具有良好的分辨率和高準確性，可以區(qū)分2-3種模態(tài)的樣本，但是對于外泌體類的樣本，NTA無法分辨外泌體，囊泡和脂蛋白，同時NTA也無法對不同來源的外泌體進行區(qū)分。對于DLS，作者認為該方法十分簡便，微量樣本即可完成測量，但是該方法測得的粒徑值與真實情況相比偏差較大，并且該方法無法測量樣品顆粒濃度。TEM方法則可以直接實現(xiàn)樣本顆粒的可視化測量，但是該方法成本高昂，費時費力。對于RPS，作者認為該方法可以直接測量顆粒真實粒徑（尤其是未知樣本的顆粒特征情況下），并對多模態(tài)的混合樣本有良好的分辨率。

表1. 四種不同粒徑分析方法的特點匯總

通過該工作，作者系統(tǒng)的評估了包括濃度，儀器閾值，曝光度，泵流速等因素對NTA性能的影響，他們發(fā)現(xiàn)在濃度為10⁸~10⁹，泵流速為50AU時，對于顆粒樣本可以得到較為精確的表征結(jié)果，同時，他們也提出對于儀器閾值及曝光度這兩個參數(shù)，則需要結(jié)合樣本的粒徑具體問題具體分析。同時，他們也發(fā)現(xiàn)NTA對于多分散樣品分析能力不佳，而RPS則可以成功的區(qū)分三峰或四峰樣品，表明RPS對于多分散樣本具有更優(yōu)異的區(qū)分能力。同時作者選用多種表征手段對兩種外泌體進行了分析，各個表征手段所得到的粒徑與濃度并不相同，因此作者認為在進行生物學(xué)顆粒研究時，需要運用正交方法學(xué)對顆粒進行多重表征。

參考文獻