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非天然氨基酸（ncAAs）是一類不受遺傳密碼子約束的特殊氨基酸，它們具有空間構型和化學性質，通過將它們精準地結合到蛋白質中，我們可以為蛋白質賦予新的化學、物理和生物活性。近年來，隨著生物技術和醫藥領域的快速發展，非天然氨基酸在生物學研究、藥物開發以及醫學診斷等方面展現出巨大的應用潛力。無細胞蛋白質表達(CFPS)作為一種創新的蛋白質表達平臺，極大的促進了人工蛋白質的表達，通過整合ncAAs，開發了許多靈活的方法，可顯著提高ncAAs的整合效率。
今天就和大家分享Front Bioeng Biotechnol期刊上名為“Emerging Methods for Efficient and Extensive Incorporation of Non-canonical Amino Acids Using Cell-Free Systems”的文獻。
一、研究背景
無細胞蛋白質合成（CFPS）已成為在特殊應用中生產重組蛋白質的有效方法。通過消除細胞膜屏障和細胞活力約束，CFPS比體內蛋白質表達有明顯的優勢：1.CFPS的開放性，使得研究人員可以精確地操縱系統中分子；2.無需考慮細胞活性，有毒試劑和難以表達的蛋白質可以在CFPS中使用，甚至可以應用一些沒有生物相容性的反應條件；3.無需使用活細胞，生物安全可以得到保證。因為CFPS系統的這些特點讓其在ncAA整合中也具有顯著優勢，包括能處理有毒ncAAs、簡化后續反應流程以及避免細胞內整合的限制等。
然而ncAAs在CFPS中的整合過程會受到內生競爭影響，為了精確合并ncAAs，需重新分配特殊密碼子。雖然研究人員已對終止密碼子和有義密碼子進行了重新分配，但ncAAs復合物與內源性生物分子間的密碼子競爭仍會導致蛋白質錯誤或截斷。
圖1:CFPS系統制備和ncAAs合并中的內源競爭的示意圖
二、消除競爭的策略
密碼子的競爭，會嚴重影響ncAAs整合的效率。目前，消除競爭的方法包括基因組工程、蛋白質消除、tRNA操作和氨基酸替代。
圖2:消除ncAAs競爭的不同策略
1.基因組工程
在蛋白質合成過程中，琥珀密碼子（UAG）通常被肽鏈釋放因子1（RF1）識別作為翻譯終止的信號。然而，通過基因組工程，研究人員可以重新分配UAG的功能，使其能夠編碼ncAAs。這種策略的一個關鍵步驟是刪除編碼RF1的prfA基因，通過刪除該基因，RF1的表達被抑制，從而減少了RF1與UAG的結合，使UAG能夠被ncAAs的轉運RNA（tRNA）識別并插入對應的ncAAs。這種方法在多種生物系統中均被證明是有效的，為ncAA的精確插入提供了可能。
2.蛋白質消除策略
由于開放式反應環境可以直接控制，CFPS系統相比于體內翻譯系統更靈活。各種消除競爭策略只有在CFPS系統中才有可能。其中從CFPS系統中消除蛋白質的競爭是一個重要的消除策略，通過操縱蛋白質水平來保持對細胞生長至關重要的蛋白質活性，同時從CFPS系統中去除可能產生競爭的蛋白質。
CFPS系統中的蛋白質消除策略對于提高蛋白質合成效率和控制產物純度至關重要。通過選擇性去除或失活特定蛋白質，如RF1，可以優化CFPS系統的性能，并促進nAAs的插入，從而擴展蛋白質的功能和應用范圍。這些策略的實施依賴于基因工程和蛋白質工程的進展，以及針對特定蛋白質的定制化消除方法的開發。
3.tRNA的操作
當ncAAs以有義密碼子插入蛋白質時，內源性氨基酰-tRNA將在翻譯過程中與核糖體中的ncAA氨基酰-tRNA競爭，從而產生部分天然蛋白質。直接操作細胞中的tRNA是不現實的，但在沒有膜屏障的CFPS中操縱是很方便，通過操縱tRNA釋放大量有義密碼子用以插入ncAAs。考慮到tRNA和密碼子之間的一對一對應，人工密碼子表，甚至最小密碼子組合都可以通過CFPS中的tRNA操縱來實現。
4.替換氨基酸
在生物合成過程中ncAAs的插入提供了一種在蛋白質中引入新特性的方法。然而，由于天然氨酰tRNA合成酶（aaRS）對氨基酸的特異性較為寬松，少數結構上與標準氨基酸相似的ncAAs能夠被對應的aaRS識別并裝載到原生的tRNAs上。這些結構相似的ncAAs可以替代相應的標準氨基酸在蛋白質中發揮作用。一種稱為“氨基酸替換CFPS”的方法，作為ncAA整合策略的一種成本效益高且簡單的替代方案，不需要改造aaRS或tRNAs。
三、CFPS的新型ncAAs和體外氨基酰化方法
在新型ncAAs方面，研究人員通過化學合成和基因工程手段，設計和合成了大量具有特定功能的ncAAs。這些ncAAs通常帶有特殊的化學基團，如熒光基團、生物正交反應基團等，這使得它們能夠在不干擾內源性生物過程的同時，賦予蛋白質新的功能或特性。
圖3:新型ncAA僅用于CFPS
在體外氨酰化方法方面，可通過優化氨酰化反應條件、開發新型氨酰化酶或氨酰化試劑等，使得ncAAs能夠高效、準確的整合到蛋白質中。這些方法的開發不僅提高了CFPS中ncAAs的整合效率，還擴大了可用于CFPS的ncAAs的種類和范圍。
圖4:體外氨基酰化方法與CFPS相結合
四、總結
CFPS作為設計遺傳密碼的強大平臺，特別是其高效整合ncAAs的能力，可以通過基因組工程、肽釋放因子消除、tRNA操作和氨基酸替代等多種策略來優化人工蛋白質的合成效率和產量。這些策略使得多個密碼子可以被重新分配給不同的ncAAs，無需內源性競爭，為人工蛋白質合成提供了更大的靈活性。CFPS在多個新興領域如抗體藥物、蛋白質標記和肽基材料中的應用潛力巨大，特別是在酶活性改善方面的潛力，例如通過ncAAs的整合來模擬或增強酶的磷酸化、甲基化等關鍵修飾。研究人員可以通過選擇合適方法，將CFPS高效整合ncAAS中，并激發ncAAs技術和應用的未來突破。
綜上所述，CFPS在ncAAs方面具有廣闊的應用前景。隨著技術的不斷發展和完善，CFPS結合ncAAs將在藥物研發、材料科學、生物學研究和合成生物學等領域發揮越來越重要的作用。
目前珀羅汀生物基于自研無細胞蛋白表達（CFPS）平臺，推出非天然氨基酸定點插入蛋白表達服務！這標志著珀羅汀生物成為可以提供基于自主知識產權的CFPS系統，進行非天然氨基酸定點插入相關的設計、服務、生產解決方案供應商！
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