光片顯微鏡技術(shù):探索不同光片的特性與應(yīng)用
光片顯微鏡(LSFM)已成為生命科學(xué)研究中buke或缺的工具,特別是在需要長(zhǎng)時(shí)間觀察活體培養(yǎng)時(shí)。選擇合適的光束類型可以顯著提高成像效果,確保獲得高分辨率和高對(duì)比度的圖像。本文將為您介紹幾種主要的光束類型,包括高斯光束、貝塞爾光束、Airy光束、晶格光束、聚焦平頂光束、雙光束和球差光束,并探討它們?cè)诠馄@微鏡中的各自優(yōu)勢(shì)、軸向分辨率、潛在的假象微影及其適用場(chǎng)景。
圖 1 顯示了比較中包含的六種光片類型的示意圖。利用照明物鏡后焦平面電場(chǎng)的幅度和相位來(lái)模擬樣品體積中光束的強(qiáng)度分布。展示了光束掃描或光片抖動(dòng)產(chǎn)生的光片在照明和檢測(cè)軸(YZ)以及掃描軸和檢測(cè)軸(XZ)上的截面。
光片截面:
YZ 軸:沿照明和檢測(cè)軸的截面
XZ 軸:沿掃描軸和檢測(cè)軸的截面
六種光片類型
高斯光束光片
簡(jiǎn)介:激光理想情況下發(fā)射高斯光束,高斯光束的強(qiáng)度分布沿徑向方向遵循高斯分布,并在傳播方向上保持這種分布。
生成方法:通過(guò)圓柱透鏡生成,或通過(guò)在檢測(cè)物鏡的焦平面掃描高斯光束生成。
特點(diǎn):這種光片類型最為常見(jiàn),具有保守的強(qiáng)度分布。
聚焦平頂光束光
簡(jiǎn)介:通過(guò)均勻照明物鏡的后焦平面生成,焦平面中的強(qiáng)度分布稱為“艾里盤”。
生成方法:擴(kuò)展高斯光束,使其直徑遠(yuǎn)大于物鏡后焦平面。
特點(diǎn):更多的光以較大的角度進(jìn)入焦點(diǎn),從而實(shí)現(xiàn)更緊的聚焦,但代價(jià)是產(chǎn)生附加的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
貝塞爾光束晶格光片
簡(jiǎn)介:等間距貝塞爾光束的相干疊加形成的光片。
生成方法:根據(jù)光束間隔的距離,產(chǎn)生不同的干涉圖樣,如方形晶格和六邊形晶格。
特點(diǎn):通過(guò)調(diào)整參數(shù)b,可以在主瓣厚度和光學(xué)切片之間進(jìn)行權(quán)衡。
艾里光束光片
簡(jiǎn)介:具有“香蕉狀”彎曲形狀的光束,通過(guò)對(duì)高斯光束施加三次相位生成。
生成方法:例如,使用空間光調(diào)制器。
特點(diǎn):具有自重構(gòu)特性,可以在散射或吸收障礙物后恢復(fù)其初始強(qiáng)度分布。
球差光束光片
簡(jiǎn)介:當(dāng)用于聚焦平行光的物鏡用于聚焦散焦或聚焦光時(shí),焦點(diǎn)遠(yuǎn)離物鏡的本地焦平面,產(chǎn)生球差光束。
生成方法:通過(guò)徑向依賴的雙二次相位掩模模擬。
特點(diǎn):weiyi一個(gè)在沿照明軸的剖面不對(duì)稱的光束。
雙光束光片
簡(jiǎn)介:由兩個(gè)光束(“子光束”)聚焦通過(guò)物鏡,然后相對(duì)于彼此和物鏡的光軸以一定角度傳播,并在物鏡的焦平面產(chǎn)生干涉圖案。
生成方法:通過(guò)分裂激光光束,將兩個(gè)子光束對(duì)稱地送入后焦平面。
特點(diǎn):生成一個(gè)光片堆棧,中央和zui強(qiáng)的光片放置在檢測(cè)透鏡的焦平面上,輔助光片照亮平行平面。
圖 1 通過(guò)展示不同類型光片在樣品體積中的強(qiáng)度分布,比較了這些光片在實(shí)際應(yīng)用中的效果和特點(diǎn)。通過(guò)對(duì)比,可以更直觀地了解每種光片類型在特定應(yīng)用中的優(yōu)缺點(diǎn)。
高斯光束
簡(jiǎn)單高效的經(jīng)典選擇
高斯光束以其生成和控制的簡(jiǎn)便性著稱。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的圓柱透鏡或聚焦透鏡即可生成高斯光束,光束能量集中在中心,呈高斯分布。
高斯光束在軸向分辨率方面表現(xiàn)出色,能夠清晰分辨樣品中的細(xì)節(jié)。其單一主瓣結(jié)構(gòu)減少了成像中的背景噪聲,提高了圖像對(duì)比度。在厚樣品中成像時(shí),高斯光束產(chǎn)生的散射偽影較少,圖像清晰度更高。因此,對(duì)于需要高分辨率和高對(duì)比度、光敏感或標(biāo)記密集的樣品,高斯光束是理想的選擇。
貝塞爾光束
大視野成像的利器
貝塞爾光束通過(guò)相位調(diào)制裝置生成,具有自重建特性,能夠在遇到障礙后重建其初始強(qiáng)度分布。這使得貝塞爾光束在較大范圍內(nèi)保持高分辨率成像成為可能。
貝塞爾光束在大視野范圍內(nèi)提供高分辨率成像,特別是在雙光子激發(fā)下,其軸向分辨率顯著提高,適合三維大尺度樣品的成像。然而,貝塞爾光束的旁瓣結(jié)構(gòu)可能引入更多背景信號(hào),降低圖像對(duì)比度。對(duì)于需要在大范圍內(nèi)保持高分辨率成像的實(shí)驗(yàn),如三維大尺度樣品成像,貝塞爾光束是zuijia選擇。
Airy光束
復(fù)雜環(huán)境中的成像專家
Airy光束通過(guò)施加立方相位調(diào)制生成,具有“香蕉”形的彎曲形態(tài)和自重建特性,能夠在遇到散射或吸收障礙時(shí)部分恢復(fù)其初始形態(tài)。
Airy光束在復(fù)雜環(huán)境中成像表現(xiàn)優(yōu)異,特別是在高散射介質(zhì)中。盡管其旁瓣增加了光片厚度,可能降低圖像對(duì)比度,但在特定應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)依然明顯。Airy光束適用于需要在復(fù)雜環(huán)境中成像的實(shí)驗(yàn),尤其是在高散射介質(zhì)中的應(yīng)用。
晶格光束
高時(shí)空分辨率的理想選擇
晶格光束是貝塞爾光束的衍生,利用多個(gè)貝塞爾光束的相干疊加形成。其優(yōu)勢(shì)在于提供了更高的時(shí)空分辨率和更好的光片均勻性。
這種光束能夠在較大的視野范圍內(nèi)保持一致的分辨率,但生成復(fù)雜,需要精確的光學(xué)控制。對(duì)于需要高時(shí)空分辨率的實(shí)驗(yàn),如觀察細(xì)胞內(nèi)部動(dòng)態(tài)過(guò)程,晶格光束是理想選擇。
聚焦平頂光束
均勻照明的可靠選項(xiàng)
聚焦平頂光束通過(guò)均勻照明背焦平面生成,光束在焦平面上形成均勻的亮斑,通常稱為Airy盤。
這種光束在軸向和橫向分辨率之間提供了良好的平衡,適用于需要均勻照明的實(shí)驗(yàn)。雖然生成相對(duì)復(fù)雜,但在需要高均勻性的成像應(yīng)用中,聚焦平頂光束表現(xiàn)出色。
雙光束
靈活調(diào)控的成像工具
雙光束通過(guò)兩個(gè)相互干涉的光束生成,能夠形成交替的亮暗條紋結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)在光片顯微鏡中生成多個(gè)平行光片,增加了成像的靈活性。
雙光束適用于需要高分辨率和大視野成像的應(yīng)用,尤其是需要頻繁調(diào)節(jié)光束參數(shù)的實(shí)驗(yàn)。在復(fù)雜樣品的三維成像中,雙光束能夠提供dute的優(yōu)勢(shì)。
球差光束
應(yīng)對(duì)折射率失配的利器
球差光束通過(guò)施加球面相位調(diào)制生成,能夠在折射率失配的情況下保持較長(zhǎng)的焦深。其優(yōu)勢(shì)在于在不同介質(zhì)中保持一致的成像質(zhì)量。
對(duì)于需要在不同介質(zhì)中成像的實(shí)驗(yàn),尤其是需要在透明介質(zhì)和高折射率介質(zhì)之間切換的應(yīng)用,球差光束是理想選擇。
推薦與結(jié)論
綜合考慮不同光束的特性和優(yōu)勢(shì),高斯光束以其高分辨率和高對(duì)比度,適用于大多數(shù)成像應(yīng)用;貝塞爾光束在大視野高分辨率成像中表現(xiàn)出色,適合三維大尺度樣品;Airy光束在復(fù)雜環(huán)境中成像具有dute優(yōu)勢(shì);晶格光束、聚焦平頂光束、雙光束和球差光束則在特定應(yīng)用中提供了不可替代的優(yōu)勢(shì)。
選擇合適的光束類型,將幫助研究人員獲得最佳的成像效果,從而更好地觀察和研究活體培養(yǎng)。光片顯微鏡的光束選擇不僅是技術(shù)的選擇,更是科研成功的關(guān)鍵。
閱讀原文:
Elena Remacha, Lars Friedrich, Julien Vermot, and Florian O. Fahrbach, "How to define and optimize axial resolution in light-sheet microscopy: a simulation-based approach," Biomed. Opt. Express 11, 8-26 (2020)
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