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細(xì)胞攻略 | T84(人結(jié)腸腺癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞)培養(yǎng)教程

來源:武漢尚恩生物技術(shù)有限公司   2024年07月30日 11:16  

--細(xì) 胞 基 本 信 息---

細(xì)胞名稱: T84(人結(jié)腸腺癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞)

細(xì)胞別稱: T-84; T84

細(xì)胞貨號: SNL-456

生長特性: 貼壁

培養(yǎng)條件: DMEM+10% FBS+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境: 37℃;5% CO2;飽和濕度

細(xì)胞簡介 T84細(xì)胞是從一位72歲男性結(jié)腸癌患者的肺轉(zhuǎn)移灶獲得的腫瘤組織皮下接種于BALB/c裸鼠,并連續(xù)進(jìn)行移植后建立的。在裸鼠身上的移植過程中,細(xì)胞株始終保持結(jié)腸癌的原始組織性狀,裸鼠傳代23代后建立了T84細(xì)胞。T84細(xì)胞有許多肽類激素和神經(jīng)遞質(zhì)的受體,并維持載體電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。T84細(xì)胞單層生長到飽和,與相鄰細(xì)胞緊密連接并具有橋粒,角蛋白陽性。T84細(xì)胞可以用于3D細(xì)胞培養(yǎng)和癌癥研究。

 

T84細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

1. 呈島狀/片狀/塊狀生長

這是該細(xì)胞的特性,是正常現(xiàn)象,并不是細(xì)胞發(fā)生“聚團(tuán)”,無需擔(dān)心。細(xì)胞間連接緊密,在70%~80%密度時(shí)細(xì)胞實(shí)際數(shù)量其實(shí)比較大了,此時(shí)需要傳代。

圖片1.jpg

 

▲細(xì)胞正常生長形態(tài)照片

 

2. 消化時(shí)間較長

該細(xì)胞消化時(shí)間較長,參考時(shí)間約5-15min,接種時(shí)間越長/細(xì)胞密度越大,消化時(shí)間越長。不同品牌胰酶消化能力不一樣,根據(jù)具體情況調(diào)整(具體步驟見下文)

 

3. 貼壁較慢

該細(xì)胞傳代/復(fù)蘇后貼壁慢,大約需要48h貼壁,因此傳代/復(fù)蘇后建議48h后換液。

 

4. 生長速度較慢

該細(xì)胞生長較慢,接種密度不可過低,推薦傳代比例1:2,傳代周期3-4天。

 

5. 黑點(diǎn)較多

該細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)背景中可能有黑點(diǎn),為細(xì)胞代謝產(chǎn)物和細(xì)胞碎片,不影響細(xì)胞生長。若黑點(diǎn)較多可以通過PBS潤洗或換液清除

 

6. 存在漂浮細(xì)胞

培養(yǎng)時(shí)存在部分漂浮的細(xì)胞是正常現(xiàn)象,不影響細(xì)胞生長。漂浮細(xì)胞過多時(shí)可換液清除。

 

T84細(xì)胞傳代方法

1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、胰酶、PBS、離心管、培養(yǎng)瓶以及無菌槍頭等;(試劑提前預(yù)熱)

2. 抽走培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基,加5mL PBS潤洗1-2遍,清除殘留培養(yǎng)基;

3. 盡量吸干潤洗的PBS后加1mL胰酶,搖晃使胰酶均勻覆蓋瓶底,放置培養(yǎng)箱37℃消化;

4. 消化時(shí)每隔5 min拿出來觀察,部分細(xì)胞開始脫落時(shí),吸取瓶中胰酶將細(xì)胞都吹下來,然后加入3-4mL含血清的培養(yǎng)基終止消化,吹打混勻后立刻離心;

Tips:

細(xì)胞部分脫落后先用胰酶將細(xì)胞都吹下來再終止消化,避免細(xì)胞重新貼壁

變圓但未脫落時(shí)需要繼續(xù)消化,確保細(xì)胞是被胰酶消化下來而不是被強(qiáng)行吹下的

5. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中,1000rpm,3min離心收集細(xì)胞;

6. 在新的培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基;(T25推薦10mL,T75推薦15mL)

7. 離心完成后,棄上清,加入適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸吹散細(xì)胞,將細(xì)胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中,十字法或8字法混勻,然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),注意培養(yǎng)瓶蓋透氣;

Tips:

全程注意控制吹打力度輕柔,吹打次數(shù)不可過多,避免機(jī)械損傷

 

 

T84細(xì)胞凍存方法

1. 配制程序性凍存液,準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量凍存管并做好標(biāo)記。

Tips:推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完quan培養(yǎng)基+8%DMSO

2. 先將細(xì)胞按傳代步驟消化、離心、棄上清,獲得細(xì)胞沉淀;

3. 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細(xì)胞,并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中;

4. 將凍存管放入程序性凍存盒,放入-80℃冰箱過夜;

5. 轉(zhuǎn)移凍存細(xì)胞至液氮保存并登記細(xì)胞保存位置

Tips:

液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測凍存細(xì)胞的活性,若活性合格即可長期保存。

程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用,若使用非程序凍存液請按產(chǎn)品說明書處理降溫過程。

T25培養(yǎng)瓶長滿通常可凍存2-3管,10cm皿長滿通常可凍存3-4管。

凍存密度低將導(dǎo)致復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)不佳。

 

T84細(xì)胞復(fù)蘇方法

1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃,培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃,離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速;

2. 將細(xì)胞從液氮罐中取出,觀察管內(nèi)無液氮的情況下,捏住管蓋,將細(xì)胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃,細(xì)胞融化至米粒大小冰塊時(shí)終止水浴,融化過程不超過2min;

Tips:

若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn),細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運(yùn)送至細(xì)胞房。

凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮,取出細(xì)胞時(shí)震動不要過大。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮,若有液氮需靜置一會待液氮完quan蒸發(fā)后再水浴。做好防護(hù),避免凍存管炸開導(dǎo)致受傷。

水浴時(shí)使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源,避免污染。

 

3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min,不同離心機(jī)具體轉(zhuǎn)速會有差異

4. 離心完成后棄上清,用預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管,輕柔重懸細(xì)胞后接種至培養(yǎng)瓶中,輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱;

5. 復(fù)蘇24小時(shí)后觀察細(xì)胞貼壁情況。

Tips:

整個(gè)細(xì)胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。

該細(xì)胞貼壁需要穩(wěn)定的環(huán)境,復(fù)蘇完成后請勿頻繁將細(xì)胞拿出觀察。

 

 

T84細(xì)胞收貨攻略

常溫細(xì)胞

1. 收貨后,拆開外包裝,用75%酒精消毒T25瓶表面,放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上;

2. 吸走大部分培養(yǎng)基并10-12 mL,顯微鏡下拍照保存細(xì)胞狀態(tài)照片,觀察細(xì)胞密度,若細(xì)胞密度大于80%即可按比例傳代(首ci傳代比例建議1:2),若細(xì)胞密度低于70%可以10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養(yǎng);

凍存細(xì)胞

1. 細(xì)胞收貨后盡快開箱檢查,若干冰充足可以取出細(xì)胞迅速置于-80℃冰箱(2-3天內(nèi)復(fù)蘇)短期保存或液氮中長期保存,若干冰完quan揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細(xì)胞并聯(lián)系銷售人員解決;

2. 凍存細(xì)胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查,以免超出售后期,復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略;

3. 復(fù)蘇一管細(xì)胞出現(xiàn)異常及時(shí)聯(lián)系銷售人員,在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進(jìn)行下一步操作;

Tips:

細(xì)胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完quan揮發(fā)等異常情況時(shí),及時(shí)拍照聯(lián)系銷售人員;

尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細(xì)胞內(nèi)含對應(yīng)細(xì)胞的完quan培養(yǎng)基,可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后,取上清于4℃保存用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng);

 

 

 

常見問題及解決方案

細(xì)胞密度怎么計(jì)算的?

嚴(yán)格意義上,細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量,但在實(shí)際培養(yǎng)過程中,并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而消化細(xì)胞計(jì)數(shù)。因此,常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對于最大生長密度的比值,貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示,即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部,有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值,當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個(gè)細(xì)胞生長不同密度時(shí)所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn),但也是相當(dāng)直觀、簡便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式。

 

NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理?

1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光,這個(gè)屬于細(xì)胞自身特性,無法清除也無法改變,大部分細(xì)胞都會有這種現(xiàn)象,只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別,細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加,建議使用合適的培養(yǎng)條件。

2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物,可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除,再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞,消化完成后加完quan培養(yǎng)基終止消化,混勻細(xì)胞,收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min,棄上清。再加5mL PBS重懸細(xì)胞,再離心后,用完quan培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片,如果平時(shí)碎片比較少,傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟;如果碎片很多,建議PBS多洗幾次。

 

NO.3細(xì)胞具體消化時(shí)間是多久?

每個(gè)實(shí)驗(yàn)室用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣,不能完quan規(guī)定消化時(shí)間,以實(shí)際消化效果和實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)為準(zhǔn)。 

 

 

產(chǎn)品推薦:

SNL-456】 T84 (人正常乳腺上皮細(xì)胞)

SNLM-456】T84細(xì)胞專用完quan培養(yǎng)基


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