本文要點：熒光側向層析免疫測定（LFA）因其簡單、靈敏和靈活而成為快速篩選各種生物標志物的有力工具。值得注意的是，熒光探針主要決定了LFA的分析性能。由于發射和激發波長位于可見光區域，因此大多數熒光團不可避免地受到光散射和背景自發熒光的影響。本文報道了一種基于第二種近紅外（NIR-II）熒光探頭的新型LFA傳感器，具有優異的抗干擾能力。設計的NIR-II探頭是Nd3+和 Yb3+摻雜稀土納米顆粒（RENPs），以Nd3+摻雜作為能量供體和 Yb3+作為能量受體，供體-受體能量轉移（ET）效率達到80.7%。同時，依靠聚乳酸-乙醇酸（PLGA）微球對RENPs的方便有效的包封策略，獲得了表面功能化的NIR-II探針（RE@PLGA），用于后續生物偶聯。得益于NIR-II探針的光學優勢，該近紅外LFA在檢測肝細胞癌（HCC）的重要生物標志物α胎蛋白（AFP）方面顯示出良好的線性關系，范圍為7 ng/mL至200 ng/mL。檢出限（LOD）低至3.0 ng/mL，比臨床臨界值低8.3倍。基于這種高效RENPs探針的LFA傳感器有望為生物樣品中各種生物標志物的高靈敏度檢測提供新的機會。

動物活體成像系統

方案 1.基于高效NIR-II探頭的LFA傳感器設計方案

在這項工作中，作者設計并合成了一種基于Nd3+和 Yb3+的高效NIR-II探針REMPs，以 Nd3+作為能量供體和 Yb3+作為能量受體。由于敏化劑離子 Nd3+的高能量轉移過程到發射極離子 Yb3+，該RENPs探針表現出較高的ET效率和背景熒光的抗干擾能力。同時，依靠PLGA微球對RENPs的方便高效的包封作用，獲得了表面功能化的NIR-II探針（RE@PLGA），用于后續的生物偶聯。通過使用RE@PLGA作為熒光報告基因，開發了一種新型NIR-II LFA傳感器來檢測α胎蛋白（AFP），AFP是診斷肝細胞癌（HCC）的一種極其重要的生物標志物[24]。所提出的NIR-II LFA具有靈敏度高、可靠性好、響應快等優點。它有望成為POCT的強大技術，它將進一步體現其在初級保健、快速診斷和大規模篩查方面的價值。

圖 1.RENPs探針的內在ET機制（Yb@Y-Nd70%@Y）

先前的研究表明，它在敏化劑離子Nd3+和發射極離子 Yb3+之間具有很高的能量轉移效率（高達70%）。本文合成了 Nd3+和 Yb3+摻雜的RENPs進行了一些修改。RENPs的結構示意圖呈現明顯的核殼結構，其結構成分為NaYbF4@NaYF4：Nd70%@ NaYF4（表示為Yb@Y-Nd70%@Y）（圖 1a）。特別是NaYbF4NPs是活化劑，位于內核，可以快速接收來自Nd3+離子的能量。由于 Nd3+離子的吸光系數高于Yb3+離子，它作為有效的光吸收劑和敏化劑，其摻雜濃度被調節在很大的范圍內（從30%到95%）。為避免摻雜濃度過高而產生嚴重的交叉松弛效應，摻雜濃度為Nd3+離子（Nd70%）分布在次級外層（NaYF4：Nd70%）。此外，NaYF4在最外層涂覆，以保護內部敏化劑和活化劑免受表面淬火。

基于NIR-II探針的LFA原理解釋如下：RENPs（Yb@Y-Nd70%@Y）探針具有高ET效率和光學性能，能夠避免生物樣品的背景干擾，對于實現腫瘤生物標志物的高靈敏度和準確檢測至關重要。從方案1 開始，將 AFP 包被抗體 （AFP-09） 設置為測試線（T 線）和 IgG 作為對照線（C 線）分別噴灑在硝酸纖維素 （NC） 膜上。將含有AFP和RE@PLGA-Ab溶液的生物樣品預混，然后加入檢測卡的樣品孔中，然后加入樣品緩沖液。樣品液體沿試紙飛到NC膜上，形成的免疫復合物（RE@PLGA-Ab-AFP-10）與AFP包被抗體特異性反應，在T線形成夾心結構（RE@PLGA-Ab-AFP-AFP09）。多余的 RE@PLGA-Ab 復合物與固定在 C 線上的 IgG 非特異性結合，作為質量控制信號。在808 nm激發光下，NIR-II熒光免疫分析儀分別記錄了T線和C線產生的NIR-II熒光發射信號（980 nm）。在條件下，980 nm處的AFP濃度和FL強度比值（T/C）呈現出良好的線性關系，為生物樣品中AFP的定量檢測提供了一種快速、靈敏、準確的方法。

圖2.基于高效NIR-II熒光探頭的LFA傳感器的分析性能

在條件下，開發了一種基于高效NIR-II探頭的新型LFA傳感器，用于AFP的測定。隨著AFP濃度的增加，熒光強度比（T/C）逐漸增加。AFP 濃度和 T/C 值在 7.0 ng/mL 至 200 ng/mL （y = 0.0023x + 0.0413， R = 0.9923） 之間顯示出良好的線性關系（圖2a-2c）。檢測限（LOD）估計為3.0 ng/mL，比臨床臨界值（25 ng/mL）低8.3倍（圖2 d）。此外，與先前報道的檢測方法相比，所提出的NIR-II LFA也表現出良好的靈敏度和相對較寬的線性檢測范圍。

通過分別添加四種腫瘤生物標志物（AFP、CEA、PSA 和 CA50）來估計 NIR-II LFA 的特異性。計算交叉反應性 （CR） 以評估該方法的特異性。當在制備的NIR-II LFA試紙中加入高濃度的腫瘤生物標志物（200 ng/mL）時，只有AFP的T/C值較高（0.534）。其他腫瘤生物標志物（CEA、PSA、CA50）的T/C值均低于0.02，相應的CR也不超過1.5%。結果表明，這些干擾物質對NIR-II LFA的檢測過程影響不大，表現出優異的特異性（圖2e）。由于抗體的選擇性識別能力主要決定了方法的特異性，也證明了所制備的NIR-II探針（RE@PLGA-Ab）具有良好的選擇性。

采用化學發光免疫測定法（CLIA）作為對照，進一步評估NIR-II LFA的有效性和可靠性。分別通過羅氏 CLIA（線性范圍：0.5-1000 ng/mL）、商業 AFP 試劑盒（線性范圍：10-200 ng/mL，可見熒光檢測）和擬議的 NIR-II LFA 方法（線性范圍：7.0-200 ng/mL）測定的 12 份血清樣品。首先通過SPSS軟件對樣本測試結果進行統計分析。結果表明，無論是NIR-II LFA和CLIA還是VIS LFA和CLIA均無顯著差異（P > 0.05），表明所開發的用于AFP檢測的NIR-II LFA是可靠的。進一步對3種方法的試驗結果進行了一致性分析。從圖2f-g可以看出，VIS LFA與CLIA的相關系數（R）為0.9989，NIR-II LFA與CLIA的相關系數為0.9997。與VIS LFA相比，所開發的NIR-II LFA與CLIA的吻合性更好，表明所提出的基于高效NIR-II探頭的LFA傳感器在臨床血清樣本中AFP的定量測定中具有更優異的準確度和效度。

綜上所述，我們開發了一種基于高效NIR-II熒光探針的新型LFA傳感器，用于檢測腫瘤生物標志物（AFP作為模型分析物）。所提出的RENPs探針具有三個優勢，為臨床轉化提供了廣闊的前景。首先，制備成本低，制備過程可控，便于大規模生產。其次，敏化劑離子Nd3+和發射極離子 Yb3+在RENPs內部構建了一條能量轉移高速公路，產生了優異的熒光效率。第三，PLGA微球的包封策略容易實現RENPs的表面修飾，有助于生物偶聯;由于NIR-II探頭具有優異的抗干擾能力和熒光特性，所提出的NIR-II LFA傳感器能夠實現臨床血清樣本中腫瘤生物標志物的無背景檢測，具有良好的靈敏度和寬線性范圍。該LFA傳感器可作為POCT腫瘤生物標志物的早期診斷和大規模篩查的有力工具。

參考文獻

Song, Z.; Hao, Q.; Li, B.; Yuan, Y.; Zhang, S.; Suo, Y.; Han, H.-H.; Cheng, Z., NIR-II fluorescence lateral flow immunosensor based on efficient energy transfer probe for point-of-care testing of tumor biomarkers. Chinese Chemical Letters 2024.