在生物制藥領域，單克隆細胞系的構建是藥物研發的關鍵步驟之一。SystImmune公司，一家專注于抗體研發的公司，面臨著快速構建高產量表達雙特異性抗體的單克隆細胞系的挑戰。為了應對這一挑戰， SystImmune采用了Cell Metric單克隆細胞追蹤成像儀，提高了細胞系開發的效率。 這里詳細介紹SystImmune公司如何利用 Cell Metric ™系統加速雙特異性抗體單克隆細胞系的構建。

SystImmune的細胞系開發流程

SystImmune使用CHOZN® (Sigma) 作為表達平臺。CHOZN® GS-/- CHO細胞系是一種內源性谷氨酰胺合成酶敲除細胞株，為必需氨基酸谷氨酰胺營養缺陷型，很容易據此來進行篩選。

1.微池轉染和挑選

CHOZN細胞被轉染進感興趣的基因，每孔鋪5000-10000細胞。由于采用了CHOZN系統，回收率很高，例如接種2-5板，回收率可達約80%。到第14天時孔中會有大量多克隆細胞。由于擴增所有微池是很困難的，因此會進行滴度測定來排除不表達的細胞微池。

2.微池的擴增和篩選

產物表達最高的50個微池會選來擴增（通過靜態培養和搖瓶），篩選并做滴度測定。靜態擴增包括將微池細胞從96孔轉至24孔板，然后轉至T25和T75瓶中培養。搖瓶擴增包括將微池中的細胞擴增，后轉至30mL補料分批培養搖瓶中。SystImmune要對30mL補料分批培養產物進行滴度測定，這樣做的原因是有時靜態擴增的滴度數據同最終生物反應器中滴度數據并不一致。

3.微池細胞有限稀釋

使用Cell Metric單克隆細胞追蹤成像儀進行稀釋鋪板時，至少挑選3個微池，用40塊96孔板進行有限稀釋操作。先用0.3-1個細胞/孔進行鋪板，而后選擇了合適的的0.5個細胞/孔進行鋪板。

4.克隆源性確證和存檔

Solentim Cell Metric imager用于對40塊細胞板進行拍照，分別追蹤其在Day 0, Day 1 和Day 2的細胞分裂情況，并在Day 7拍照顯示其克隆形成情況。在此階段，SystImmune確認了約200-300個克隆有著高滴度值，但通常選擇至少50個Cell Metric確認的滴度最高的單細胞擴增克隆。這種單細胞克隆的確認是非常嚴格的，并需要生成相關報告用于提交IND。

5.克隆擴增

先前步驟中選出的高表達克隆（基于圖像和滴度數據）用先前同樣的方法，從靜態培養到搖瓶培養進行擴增。另用一個30mL搖瓶補料分批培養，將高表達克隆繼續擴增。

6.克隆評價

SystImmune基于細胞生長和滴度測試來最終確定哪些克隆被送到生產部門，并還需要將細胞培養上清進行純化交到分析部門，進行蛋白質量檢測——CE-SDS（毛細管電泳-SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳），HPLC-SEC（高效液相-尺寸排阻色譜），CIEF（等電毛細聚焦），結合和功能測試。他們同樣要檢測拷貝數，檢測支原體。

7.批量擴增生產

后來SystImmune挑選了8個產量較高的克隆送去生產部門，進行3L生物反應器發酵，進行活細胞密度（VCD）和IgG產量分析。

8.產生候選克隆

將好的候選克隆被挑選出來，創建研究細胞庫（RCB）。

細胞系開發過程中面臨的挑戰

同其他公司的CLD部門一樣，SystImmune公司在細胞系開發過程中也面臨著一些關鍵的問題：

l 細胞系開發過程中多步驟的復雜性

l 部門人手不夠

l 降低時間周期及成本

l 每個步驟中形成良好的規則

l 提交IND申請時可以形成規范的文件

l 可以證實細胞的克隆源性

對于后面兩點，同其他公司一樣，SystImmune公司已經敏銳地覺察到FDA對于細胞系單克隆源性的要求，FDA的Sarah Kennett博士曾做過“Establishing Clonal Cell Lines – A Regulatory Perspective’ presentation”的報告。里面概述了ICH Q5D的條款"For recombinant products, the cell substrate is the transfected cell containing the desired sequences which has been cloned from a single cell progenitor"。

為細胞的克隆源性存檔

SystImmune選擇在細胞系的開發過程中使用Solentim的Cell Metric CLD來為細胞的克隆源性存檔。Cell Metric 單克隆細胞追蹤成像儀  可以對細胞孔進行高銳利度的整孔成像，提供Day 0時的細胞狀態，從而為單克隆源性提供關鍵證據，因此只需要一輪克隆即可。

為了提供克隆源性的證據，SystImmune利用Cell Metric單克隆細胞追蹤成像儀的配套軟件的“輸出克隆報告”功能制作的報告文件。報告中展示了對所需要的細胞孔的整孔成像，接種細胞的具體位置，細胞如何隨時間逐漸分裂生長為一個克隆團（此處僅顯示了Day0和Day1）。同樣地，孔內同細胞形態相似的一些碎片和雜質也會被拍到。這些碎片或雜質是不會隨著時間而發生任何形態上的變化的，這也是證明該克隆團為單克隆的重要基礎。

使用CHOZN平臺和以前的兩輪有限稀釋，SystImmune大概要用20周的時間獲得一個好的候選細胞系交給生產部門，這是一個非常耗時的過程，對于提交一個IND申請這是一個重要的限速步驟。

闡明細胞的單克隆源性在政策法規層面是非常重要的。SystImmune使用Cell Metric CLD能夠很好的捕獲細胞接種，數量增長直至形成克隆團的圖像。

使用Cell Metric，SystImmune在細胞系建立過程中可以去掉一輪的有限稀釋，這意味著可以節省6-8周的時間仍能夠達到法規的要求。通過這種方式，SystImmune不僅加快了細胞系的開發速度，還確保了細胞系單克隆源性的合規性，這對于IND申請的提交至關重要。

SystImmune的這個案例充分展示了Cell Metric單克隆細胞追蹤成像儀在生物制藥研發中的巨大價值。通過提高細胞系開發的效率和確保單克隆源性，Cell Metric為生物制藥公司提供了加速藥物上市的關鍵工具。這不僅縮短了研發周期，還能在確保產品質量和合規性的同時，降低研發成本。

蘇州阿爾法生物的STUDIUS生態系統，通過整合VIPS PRO單細胞鋪板、Cell Metric單克隆細胞追蹤成像儀以及ICON細胞成像系統，進行 IgG產率評估，為細胞株構建提供了一個高效的一體化解決方案。這個軟件平臺允許科學家根據特定參數自定義分析，并自動、即時地處理數據，縮短了克隆排名和選擇所需的時間。這些 實驗室儀器的使用不僅提高了細胞株構建的效率和精確性，還幫助科學家加速了整個細胞開發過程。