一、抗體偶聯藥物ADC介紹

抗體偶聯藥物(Antibody-Drug Conjugate, ADC)，是一種通過連接子將抗體與具有生物活性的小分子細胞毒性載荷連接起來的新型高效生物藥物（圖1）。

ADC藥物的三大元件包括：

1）特異性靶向抗體；

2）毒素；

3）可裂解/不可裂解的連接子。

異性靶點識別及有效的毒素作用使ADC成為名副其實的“生物導dan”。 ADC藥物的開發具有較高的技術壁壘，需要綜合考慮靶點的合理選擇；抗體、連接子、小分子藥物及它們之間的合理組合；抗體偶聯技術以及ADC藥物的耐藥性等多個因素。 其中靶點的選擇、連接子的選擇、偶聯技術以及臨床前的藥效評價是ADC研發過程中關注的焦點。

圖1 ADC藥物的結構和特性^[1]

二、ADC的制備

ADC的制備始于靶抗原的選擇，ADC的安全性和有效性在很大程度上依賴于靶抗原的選擇以及和它的相互作用。然后針對靶抗原先行研制高度特異性的抗體，而后利用特定的可裂解或不可裂解的連接子片段，通過賴氨酸偶聯、半胱氨酸偶聯、定點偶聯等方式將細胞毒性載荷與抗體連接起來。

ADC制備常用途徑有兩種，一步法和兩步法。一步法是先將連接子和細胞毒性載荷連接起來再進行抗體偶聯，二步法是先將連接子與抗體偶聯再進行細胞毒性載荷的連接。ADC開發中的最大挑戰之一是為抗體和細胞毒載荷選擇適當的連接子及偶聯模式，因為除了有效輸送細胞毒載荷外，抗體-載荷連接系統的穩定性是決定ADC療效和毒性的關鍵性因素，既要保證到達腫瘤細胞前在血液循環中不會提前斷裂導致脫靶，毒性又要到達腫瘤細胞后高效釋放細胞毒性載荷，是決定ADC治療潛力的關鍵性因素。細胞毒性載荷是ADC最重要的核心構件，是最終執行殺傷腫瘤細胞（直接殺傷或旁觀者效應） 的活性成分，高毒力的載荷是使ADC發揮預期功效的關鍵。

三、ADC的關鍵要素^[2]

ADC由抗體、連接子和細胞毒性小分子藥物組成，通過抗體與腫瘤細胞表面的特異性抗原結合，實現高活性的細胞du藥物對腫瘤細胞的精準殺傷。此外，靶抗原的選擇和偶聯方式對于所設計的ADC是否具有安全、有效的臨床治療效果也是極為重要的。

1、ADC設計的起點：抗原靶點

抗原靶點的選擇需要考慮以下幾方面：

1）靶抗原在腫瘤中高表達，在正常細胞中不表達或低表達；

2）目標抗原是否在腫瘤細胞的細胞膜表面分布，因而才可以被特異性抗體所識別；

3）抗原是否不易脫落，以防止抗體與循環內的抗原結合；

4）目標抗原是否具有內化特性，這將有助于把ADC所偶聯的毒素分子攜帶入腫瘤細胞內發揮作用，且靶抗原在ADC治療后不應下調。

目前已有超過50種抗原被作為ADC所識別的靶抗原。實體腫瘤細胞過表達抗原如HER2、EGFR、CD56、Trop2、CD70、Tissue factor、Collagen IV等。目前ADC應用較多的靶抗原包括Her2、CD19、CD33、CD22、MSLN(mesothelin)等。

2、ADC中的抗體

抗體是ADC設計中的另一個重要組成部分，其應能夠特異性的識別腫瘤細胞的靶抗原并與靶抗原存在較高的親和力，如缺乏高度特異性或與其他抗原發生交叉反應，都會發生不可預測的副作用。同時，抗體還應具有免疫原性弱、半衰期長、血液循環穩定性好的特點。抗體根據其重鏈恒定區序列可分為IgG、IgA、IgD、IgE和IgM 共五類，目前已批準的ADC均采用IgG類抗體，其中IgG1由于其分子量適中、親和力高、半衰期長、制備簡便且能發揮較強的Fc效應子功能等特點，在ADC抗體研發中應用最多。

ADC普遍采用人鼠嵌合抗體（鼠源的輕重鏈可變區與人源的恒定區，如Adcetris）與人源化抗體（鼠源的CDR片段，其它序列均為人源，如Mylotarg和Kadcyla），這在一定程度上降低了免疫原性，減少了人抗鼠抗體的產生。但早期ADC仍存在一定程度的脫靶毒性、產品不均一、易聚集或快速被清除等問題，治療窗口窄。

抗體的特異性、親和力以及內化率也是需要考慮的因素。高特異性有助于將毒素小分子集中遞送至腫瘤部位，從而達到靶向的藥理作用。特異性低的ADC更有可能對正常組織產生毒性。ADC抗體應該具有較高的結合親和力，大多數ADC的結合親和力在0.1-1.0nM之間。與小分子相比，抗體從血漿進入組織的速度更慢，而較快的內化效率可以提高ADC的藥效。

ADC的抗體部分可以采用雙特異性抗體或單域抗體等形式。雙特異性抗體可針對同一靶抗原的兩個不同表位，也可針對兩個不同的靶抗原。也有采用單域抗體偶聯殺傷性放射性元素或毒性分子，用以開發新型ADC。

3、ADC中的連接子(Linker)

Linker將抗體與有效載荷連接起來。連接子在血液中的穩定性非常重要，需要在血液中保持穩定以保持細胞毒性載荷附著在抗體上，但是一旦ADC進入腫瘤細胞或被運輸到溶酶體，連接子應迅速分解以釋放有效載荷。連接子會影響ADC的許多重要特性，例如藥物-抗體比值(DAR)、有效載荷釋放時間、治療指數(Therapeutic Index, TI)和藥代動力學。

根據腫瘤細胞內連接子的切割特性，可將連接子分為可切割和不可切割兩種類型。可切割的連接子可以通過多種機制進行裂解，包括腙鍵的酸不穩定裂解、二硫鍵的還原裂解和多肽鍵的酶解。例如，酸不穩定連接在血液中通常是穩定的，但在低pH的溶酶體環境中（如Besponsa和Mylotarg）會速裂解，釋放出小分子毒素，發揮細胞殺傷作用。二硫鍵類型的則可通過細胞內谷胱甘肽(Glutathione, GSH) 還原反應釋放細胞毒載荷殺傷腫瘤細胞，并且其空間位阻作用可限制ADC在進入細胞之前的不成熟裂解。如果釋放的細胞毒載荷能穿過腫瘤細胞膜，它們就能殺死附近的癌細胞，這就是所謂的“旁觀者效應”。但可切割連接子并非一定會產生旁觀者效應，主要取決于釋放載荷的膜穿透性和電荷特性。需要注意的是，旁觀者效應也存在一些缺陷，如殺死目標腫瘤細胞附近的正常細胞或免疫細胞。可切割連接子的另一個缺陷是在體內循環時可能存在一定程度的代謝降解，導致脫靶毒性。

不可切割的連接子由具有在血液中穩定的結構組成，含有該連接子的ADC只有在進入腫瘤細胞的溶酶體被蛋白酶降解后才會釋放有效載荷。穩定連接子大大降低了胞外釋放引起的脫靶毒性，但釋放效率低，需要良好的內化過程。不可切割連接子被內吞入溶酶體后，連接子不會被降解，連接的抗體則會被降解為氨基酸，形成氨基酸-連接子-小分子細胞毒復合物。由于“連接子-氨基酸殘基”帶有電荷限制了其透膜及擴散，因而通常不會產生旁觀者效應。

4、ADC中的細胞毒性載荷

ADC所攜帶的細胞毒性載荷藥物是其最重要的效應成分，或稱為有效載荷。目前常用的細胞毒性分子包括微管生成抑制劑、DNA損傷因子和DNA轉錄抑制劑等。微管生成抑制劑通過與微管結合阻止微管的聚合，從而阻滯細胞周期，產生細胞毒性，發揮抗腫瘤作用，例如Monomethyl auristatin E(abs810174)、Maytansine(abs817384)及其類似物。DNA損傷因子則通過與DNA的小溝結合并促進DNA鏈烷基化、斷裂或交聯，例如Calicheamicin(abs819016)。DNA轉錄抑制劑有Amatoxin和Quinoline Alkaloid(SN-38)，例如CL2A-SN-38(abs819783)，由 linker CL2A和毒性分子SN-38連接而成的drug-linker conjugate，可用來制備ADC。

5、ADC的偶聯方式

偶聯方式主要分為非定點偶聯和定點偶聯。早期使用的是非定點偶聯法，主要由賴氨酸或半胱氨酸偶聯。定點偶聯方式即通過基因工程位點進行特異性偶聯，實現更均一的ADC，能在特定位點實現細胞毒素的連接。

愛必信ADC毒素抗體定點偶聯試劑盒(abs580253)操作簡便，無需抗體工程化等復雜操作，可快速實現單抗的定點偶聯。偶聯產物均一、穩定。適用于偶聯階段定點偶聯，ADC早期偶聯研究。

偶聯原理：

1）抗體疊氮化修飾

首先使用糖苷酶(EndoS)暴露單抗恒定區的保守N糖鏈上的乙酰葡糖糖胺（藍色方塊），然后使用牛半乳糖轉移酶突變體(b.GalTY298L)將帶有疊氮官能團的乙酰半乳糖胺（黃色方塊-N3）連在乙酰葡萄糖胺上。

2）毒素分子連接

隨后可使用無銅催化的炔疊氮化物環加成反應（如SPAAC）將生物素、熒光素或毒素分子等連在單抗上。

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[1] Fu Z, Li S, Han S, Shi C, Zhang Y. Antibody drug conjugate: the "biological missile" for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther[J]. 2022 Mar 22;7(1):93.

[2] 武剛,付志浩,徐剛領,等.抗體偶聯藥物研發進展[J].生物醫學轉化, 2021, 2(4):11.

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