如何提高超薄切片機(jī)的切片質(zhì)量并實(shí)現(xiàn)自動(dòng)對(duì)齊功能

超薄切片技術(shù)是獲取樣品切片的常用方法。在室溫條件制備時(shí)，將樣品小塊嵌入環(huán)氧樹(shù)脂中，然后通過(guò)修剪去除多余的樹(shù)脂，并使用玻璃刀或金剛石刀將樣品切成厚度為50-100納米之間的薄片。

切片過(guò)程涉及多個(gè)手動(dòng)制備步驟。在本應(yīng)用說(shuō)明中，我們將概述該過(guò)程，并解釋新的自動(dòng)化解決方案，如何消除復(fù)雜的手動(dòng)設(shè)置需求。

簡(jiǎn) 介

透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）等電子顯微鏡技術(shù)，廣泛應(yīng)用于獲取生物或非生物材料樣品的結(jié)構(gòu)信息。在電子顯微鏡（EM）應(yīng)用中，較厚的樣品被切割成厚度

小于100納米的超薄切片。

該樣品制備方法有助于獲取高分辨率的電子顯微鏡圖像，并且能夠進(jìn)一步通過(guò)計(jì)算重建從多個(gè)連續(xù)切片中收集的信息，從而獲得較厚樣品的概覽（體積電子顯微鏡學(xué)）。

樣品塊的修整

為了獲得具有特定厚度的均勻切片，必須執(zhí)行多個(gè)手動(dòng)步驟，并具備相應(yīng)的技能和專(zhuān)業(yè)知識(shí)。

粗 修

在切割感興趣區(qū)域之前，必須對(duì)樣品進(jìn)行初步修整，以露出目標(biāo)點(diǎn)，并去除過(guò)量的無(wú)樣品聚合物或非目標(biāo)樣品區(qū)域。通常，修整的結(jié)果是形成（堆疊的）金字塔形狀，其尺寸逐漸減小（圖1）。

圖1：經(jīng)過(guò)粗修和精修后的樣品塊。放大圖顯示了聚合物塊前端上的樣品面。聚合物塊前端面使用銑削裝置，以45°的形狀進(jìn)行修整。使用超薄 切片機(jī)和具有45°邊緣的切片刀對(duì)塊面進(jìn)行修整，

形成金字塔形狀。

首先，粗修是通過(guò)手動(dòng)使用刀片或使用EM RAPID來(lái)制備金字塔截體。EM RAPID的高速金剛石銑削頭，可以以特定角度朝向樣品，同時(shí)樣品在四輪中能夠進(jìn)行90°旋轉(zhuǎn)（圖2）。

圖2：使用EM RAPID銑削裝置對(duì)樣品塊進(jìn)行粗修。左：修整前的樣品塊。中：銑削第二個(gè)區(qū)域。右：最終粗修后的樣品。

精 修

接下來(lái)，將樣品塊安裝在超薄切片機(jī)上，并使用修塊刀減小樣品區(qū)域并塑造其形狀，以形成最終的切面。精修的目的是將樣品感興趣區(qū)域包含在小于1平方毫米的矩形或梯形區(qū)域內(nèi)，

并使上下邊緣與切片刀平行（圖3），這將在后續(xù)步驟中允許切片彼此粘附形成帶狀。帶狀切片可以整體收集，使用戶(hù)能夠按照切片的順序進(jìn)行拍攝，這對(duì)于陣列斷層掃描應(yīng)用尤其重要。

圖3：使用金剛石修塊刀進(jìn)行精修。

左：粗修后的樣品塊。中：精修前樣品塊的前端。下方可見(jiàn)一把45°金剛石修塊刀。右：樣品塊面的前端和右側(cè)已經(jīng)進(jìn)行了精修。

樣品與切片刀之間對(duì)齊

在對(duì)樣品塊進(jìn)行修整以獲得平坦且暴露的塊面后，將其正確對(duì)齊到切片刀邊緣至關(guān)重要。最終目標(biāo)是使樣品與切割平面之間的距離盡可能小，以避免樣品材料損失和切片不完整。

對(duì)齊樣品和切片刀是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。它需要精密地手動(dòng)調(diào)整樣品傾斜、旋轉(zhuǎn)和切片刀角度，同時(shí)需要正確地控制樣品進(jìn)給（進(jìn)刀）。

這對(duì)于新手或不常使用超薄切片機(jī)的用戶(hù)來(lái)說(shuō)尤其困難。不僅存在損壞昂貴切片刀的風(fēng)險(xiǎn)，而且還可能損壞樣品，無(wú)法用于切片。即使經(jīng)驗(yàn)豐富的操作人員也需要小心謹(jǐn)慎，

以確保在較薄樣品（如細(xì)胞單層）切片過(guò)程中，不會(huì)因初始位置未對(duì)齊，而損失太多材料。

方 法

為了判斷切片刀與樣品之間的距離，用戶(hù)需要使用底照光來(lái)觀(guān)察它們之間的間隙，整個(gè)過(guò)程在體視顯微鏡下進(jìn)行。底照光從下方照亮切片刀的背面，并通過(guò)樣品塊面的光滑表面反射光線(xiàn)，呈現(xiàn)為一條明亮的條紋（圖4）。這被稱(chēng)為“光隙”。

對(duì)齊表現(xiàn)為在整個(gè)塊面長(zhǎng)度上均勻?qū)挾鹊谋。ㄋ{(lán)色）光隙（見(jiàn)下文）。

圖4：切片刀背面在樣品塊面上的反射圖像。

左：概覽圖，底照光被切片刀的背面反射至樣品塊面，幾乎照亮了整個(gè)前端面。右：用切片刀接近樣品時(shí)，塊面上的反射光變成小條紋，稱(chēng)為光隙光隙是指示切片刀與塊面之間方向的工具。

以下步驟通常以迭代順序執(zhí)行，直到塊面和切片刀對(duì)齊為止。通常，兩者之間的距離可以小于500納米。

樣品旋轉(zhuǎn)

為確保切片能夠彼此粘附并形成帶狀，切片的上下邊緣必須平行。這只有在整個(gè)塊面與切片刀接觸時(shí)才能實(shí)現(xiàn)。因此，必須旋轉(zhuǎn)樣品以使其與切片刀邊緣平行（圖5）。

圖5：調(diào)整樣品旋轉(zhuǎn)。左：樣品旋轉(zhuǎn)與切片刀邊緣的示意圖。中：樣品未正確旋轉(zhuǎn)。右：樣品正確對(duì)齊到切片刀。

首先，將切片刀座移至足夠接近樣品的位置，以產(chǎn)生光隙。一旦在塊面上觀(guān)察到光隙，用戶(hù)需要調(diào)整樣品旋轉(zhuǎn)，使塊面下邊緣與切片刀平行。如果未調(diào)整切片刀角度，可能無(wú)法使樣品和切片刀平行，因?yàn)閴K面尚未被修塊刀修整。

切片刀角度

為了補(bǔ)償塊面表面與切片刀之間的角度，需要旋轉(zhuǎn)切片刀，直到塊面的前導(dǎo)邊緣與切片刀平行（圖6）。這將確保樣品從左到右的整個(gè)區(qū)域與切片刀接觸，從而提供完整的切片，不會(huì)損失太多樣品材料。此外，上述操作確保樣品切割均勻，并使切片能夠彼此粘附，在切片刀水槽中形成條帶（圖6，下圖）。

圖6：調(diào)整切片刀角度。左上：切片刀和樣品塊面的示意圖。藍(lán)色切片刀以其邊緣與塊面平行的方式轉(zhuǎn)動(dòng)。中上圖像：底照光照亮的塊面圖像。切片刀邊緣在圖像底部可見(jiàn)為黑色條紋。

切片刀邊緣必須與塊面的下邊緣平行，但在這里并非如此。右上圖像：調(diào)整切片刀角度，使其與塊面邊緣平行。下圖像：切片在切片刀水槽中形成條帶。切片具有平行的邊緣，因此彼此粘附。

樣品傾轉(zhuǎn)

樣品傾轉(zhuǎn)是最關(guān)鍵但不易觀(guān)察的影響參數(shù)之一。如果樣品傾轉(zhuǎn)不正確，切片刀在切割過(guò)程中將不會(huì)與樣品運(yùn)動(dòng)保持一致。因此，在獲得完整切片之前，可能會(huì)丟失珍貴的樣品。

通過(guò)弧形樣品夾以調(diào)整塊面與切片刀邊緣之間的角度，可以調(diào)節(jié)樣品傾轉(zhuǎn)。以光隙為指標(biāo)，用戶(hù)在調(diào)整過(guò)程中需要上下移動(dòng)樣品，直到光隙在整個(gè)塊面上顯示相同的厚度（圖7）。

這需要通過(guò)迭代方法來(lái)調(diào)整樣品傾轉(zhuǎn)。在這個(gè)階段，切勿將切片刀太靠近樣品，否則塊面的離切片刀較近部分可能會(huì)被切掉，從而有損失整個(gè)樣品的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，也存在切片刀損壞的風(fēng)險(xiǎn)。

圖7：調(diào)整樣品傾轉(zhuǎn)。左：樣品傾轉(zhuǎn)原理的示意圖。樣品傾轉(zhuǎn)，直到塊面表面沿切割運(yùn)動(dòng)方向與切片刀邊緣對(duì)齊。

中：上下移動(dòng)樣品時(shí)的兩個(gè)光隙圖像。灰色條紋的厚度不同。右：調(diào)整后的光隙。

以光隙為作為調(diào)整的指標(biāo)

樣品和切片刀角度調(diào)整的最后一步是使用光隙作為指標(biāo)進(jìn)行調(diào)整。在調(diào)整樣品傾轉(zhuǎn)之后，小心地將切片刀朝樣品推進(jìn)，直到切片刀與塊面之間的光隙幾乎看不見(jiàn)。在接近過(guò)程中，光隙的顏色會(huì)發(fā)生變化，

直到最終變?yōu)樗{(lán)色（顏色的變化是衍射的結(jié)果，圖8）。使用這種方法，在整個(gè)塊面上對(duì)齊偏差能夠小于1µm。從塊面反射出的藍(lán)色光隙，通常表示塊面與切片刀之間的距離約為400納米。在此距離下，

在所有角度上均勻分布的光隙是準(zhǔn)確指標(biāo)，盡可能減小材料的損失。

圖8：精細(xì)調(diào)整過(guò)程中，切片刀與塊面之間衍射產(chǎn)生的藍(lán)色光隙。

圖9：帶有電動(dòng)切片刀架（1）和弧形樣品夾（2）的UC Enuity

內(nèi)置的flexacam（i5或c5）相機(jī)，提供了切片刀和光隙的圖像，這些圖像會(huì)被分析，并將信息發(fā)送回來(lái)，以進(jìn)行自動(dòng)對(duì)齊工作（圖10）。

圖10：內(nèi)置flexacam i5相機(jī)和觸摸屏截圖，顯示帶有自動(dòng)對(duì)齊反饋線(xiàn)的圖像（也見(jiàn)下文）。

對(duì)齊過(guò)程會(huì)引導(dǎo)用戶(hù)完成接近階段，最終對(duì)齊步驟將自動(dòng)完成。這種自動(dòng)化設(shè)計(jì)旨在保護(hù)切片刀和塊面免受損壞，同時(shí)幫助用戶(hù)實(shí)現(xiàn)對(duì)齊。該功能幫助未經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的用戶(hù)，

如在核心設(shè)施或研究組內(nèi)工作的用戶(hù)，在切片刀和樣品的初始定位階段，在不承擔(dān)損壞風(fēng)險(xiǎn)的情況下獲得高質(zhì)量切片。

需要注意的是，要執(zhí)行自動(dòng)對(duì)齊功能，必須滿(mǎn)足某些先決條件。例如，塊面尺寸必須至少為250 x 250µm，最大為1200 x 1200µm。此外，塊面必須具有反射性且足夠干凈。

自動(dòng)化工作流程

開(kāi)始自動(dòng)對(duì)齊程序前，首先應(yīng)將切片刀接近塊面并居中。在用戶(hù)確認(rèn)后，將執(zhí)行自動(dòng)對(duì)齊功能（圖11）。

圖11：UC Enuity顯示屏截圖，顯示檢測(cè)光隙步驟中的相關(guān)交互按鈕（左）。自動(dòng)對(duì)齊過(guò)程中的相機(jī)圖像（右）。反饋線(xiàn)指示圖像中是否檢測(cè)到正確的邊緣。

綠色：垂直中心線(xiàn)；洋紅色：光隙的上邊緣；白色：光隙的下邊緣（此處不可見(jiàn)，與紅線(xiàn)重合）；紅色：切片刀邊緣；藍(lán)色：自動(dòng)檢測(cè)到的塊面左邊緣和右邊緣。

軟件檢測(cè)圖像中的不同邊緣，并對(duì)切片刀角度、樣品傾斜和樣品旋轉(zhuǎn)進(jìn)行迭代對(duì)齊。在此過(guò)程中，樣品會(huì)上下?lián)u動(dòng)，以觀(guān)察分析整個(gè)塊面范圍的光隙，并據(jù)此調(diào)整樣品傾斜。

在過(guò)程結(jié)束時(shí)，可以自動(dòng)將切片刀接近樣品，直到大約5µm的距離（圖12）。如果需要，也可以進(jìn)行手動(dòng)校正。

圖12：切片刀接近樣品，安全距離約為5µm。左：對(duì)齊后，用戶(hù)可以決定自動(dòng)或手動(dòng)接近樣品。右：接近后的光隙。將保持約5µm的安全距離。

多組測(cè)試結(jié)果

對(duì)齊過(guò)程的目的是避免在獲得完整切片之前，不必要地?fù)p失部分樣品區(qū)域。為了提供確鑿的證據(jù)，證明自動(dòng)對(duì)齊功能能夠可靠地產(chǎn)生高質(zhì)量切片，我們對(duì)樣品進(jìn)行了一系列超薄切片測(cè)試。

在第一組代表性樣品中，專(zhuān)家手動(dòng)進(jìn)行了對(duì)齊。通常，專(zhuān)家需要切割5-10個(gè)厚度為100nm的部分切片，直到獲得完整切片。另一組樣品使用UC Enuity的自動(dòng)對(duì)齊功能進(jìn)行修塊，其中五個(gè)不同樣品使用不同設(shè)備進(jìn)行修塊，樣品塊面尺寸不同。在兩組測(cè)試中，部分切片的平均數(shù)量均低于或等于10，而最少部分切片的數(shù)量在3到7之間（表2）。這證明使用UC Enuity可以成功實(shí)現(xiàn)自動(dòng)對(duì)齊。

表2：使用UC Enuity自動(dòng)對(duì)齊后獲得完整切片所需的部分切片數(shù)量。

測(cè)試1，n=4；測(cè)試2，n=2；測(cè)試3，n=4；測(cè)試4，n=7；測(cè)試5，n=2。

總 結(jié)

在超薄切片中，切片刀和樣品的對(duì)齊，對(duì)于實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量切片和減少獲得完整切片前的樣品材料損失至關(guān)重要。

由于對(duì)齊過(guò)程較為復(fù)雜，手動(dòng)操作時(shí)需要用戶(hù)具備豐富經(jīng)驗(yàn)，因此UC Enuity提供的自動(dòng)對(duì)齊解決方案，有助于減少非熟練和不常用戶(hù)對(duì)樣品或切片刀造成損壞的風(fēng)險(xiǎn)。

UC Enuity還幫助他們實(shí)現(xiàn)的光隙調(diào)整，為高質(zhì)量的切片提供了基礎(chǔ)。