在所有RNA實驗中,最關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩定,一般反應不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解,而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結果,所以RNA的制備與分析操作難度極大。那么你知道防止RNA酶污染的方法有什么嗎?讓我們一起來看看吧!
防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗(注意:有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕,故不能使用)。
3. 有機玻璃的電泳槽等,可先用去污劑洗滌,雙蒸水沖洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室溫10min,然后用0.1% DEPC水沖洗,晾干。
4. 配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC,在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑,應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制,然后經0.22μm濾膜過濾除菌。
RNA酶抑制劑
1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性,從而抑制酶的活性。
2. 異硫氰酸胍:目前被認為是有效的RNA酶抑制劑,它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來,又對RNA酶有強烈的變性作用。
3. 氧釩核糖核苷復合物:由氧化釩離子和核苷形成的復合物,它和RNA酶結合形成過渡態類物質,幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin):從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑,可以和多種RNA酶結合,使其失活。
5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。
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