1.CAEN可以保護(hù)和穩(wěn)定PPE蛋白的活性

2.CAEN可以特異性切割CD95促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡

在由H57、D102、S195和S214組成的PPE的活性中心周圍，Mn²⁺而不是Ca²⁺與D60和D97相互作用（圖3A，B）。此外，Mn²⁺與PPE蛋白能夠相互結(jié)合。將Mn²⁺和PPE的蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)與PPE和小分子抑制劑的蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較（圖3C），Mn²⁺改變了PPE蛋白的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)印跡實驗中白蛋白對非特異性條帶的阻斷作用相似。為了驗證不同制備組對CD95的切割能力，純化MBP-CD95蛋白并對其進(jìn)行切割實驗（圖3E-G）。MBP-CD95(200-335)的理論分子量為58.3kD（圖3D）。將不同的制劑組與MBP-CD95蛋白孵育30min（圖3E）。CAEN組和PPE蛋白組均能有效地切割MBP-CD95，但PPE組切割MBP-CD95，而CAEN組僅選擇性切割CD95蛋白。為了測試CAEN在腫瘤細(xì)胞內(nèi)切割CD95的能力，進(jìn)行了不同劑型(PBS、PPE、NP或CAEN)處理MDA-MB-231細(xì)胞和A549細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡實驗。CAEN治療組較其他對照組有較深的條帶，證實了CAEN有效切割CD95蛋白的能力（圖S14）。CAEN治療組腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例最為顯著（圖3F,G），表明CAEN具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。與PBS和PPE組相比，CAEN組與腫瘤細(xì)胞孵育6h后細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平顯著升高，CAEN組大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低，細(xì)胞內(nèi)線粒體功能受損（圖3H）。在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)一步測定了不同處理組B16-F10細(xì)胞的凋亡指數(shù)（圖3I）。

3.CAEN可提高輸送效率和肺滯留時間

將B16-F10與CAEN-FITC共孵育4h后，綠色熒光彌散在腫瘤細(xì)胞的胞漿中，表明CAEN能有效和快速地被腫瘤細(xì)胞吸收（圖4A）。為驗證氣霧劑的成功給藥，使用考馬斯亮藍(lán)溶液(CBB)作為指示劑證明藥物可以有效地進(jìn)入小鼠的肺組織。小鼠肺組織中有大量CBB溶液，主要分布在氣管和支氣管（圖4B）。使用肺霧化噴霧給小鼠注射該藥物來研究CAEN的保留情況（圖4C）。使用Cy7熒光染料標(biāo)記的PPE進(jìn)行肺噴霧給藥，熒光成像結(jié)果顯示CAEN-Cy7處理的肺組織中熒光分布更強(qiáng)、更深，表明礦化納米顆粒作為載體具有良好的穿透和保留能力（圖4D、E）。

4. CAEN體內(nèi)釋放對腫瘤生長的抑制作用

為驗證CAEN的抗腫瘤作用，將B16-F10細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注入C57BL/6小鼠，形成局部抗腫瘤治療的肺癌模型（圖5A）。分別于第5、13、21天解剖小鼠，收集肺組織。隨后，計數(shù)小鼠肺組織中的轉(zhuǎn)移灶。如圖5B、C所示，CAEN組在抗腫瘤治療期間保持了良好的療效，沒有明顯的轉(zhuǎn)移。在治療期間，小鼠的體重沒有顯著變化（圖5D）。心、肝、脾、肺和腎等主要器官的染色結(jié)果表明，CAEN并未引起這些器官明顯的病理變化（圖5E）。腫瘤組織HE染色顯示，CAEN組小鼠組織切片中癌細(xì)胞較少，而PBS組和PPE組腫瘤細(xì)胞數(shù)量較多（圖5F）。對健康小鼠進(jìn)行相同處理后，發(fā)現(xiàn)PPE治療組對健康小鼠肺組織造成炎性損傷，CAEN治療組和PBS治療組無明顯變化（圖5G）。如圖5H-K所示，TUNEL染色證實CAEN有效地誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，且CAEN組CD8⁺T細(xì)胞比例在所有治療組中最高。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CAEN能顯著減少腫瘤組織中Ki67⁺細(xì)胞的數(shù)量，有效抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖（圖S19）。

5. CAEN具有良好的生物安全性

CAEN對心、肝、腎功能無明顯影響（圖6A-C）。相比之下，PPE組各項指標(biāo)均升高，且有一定毒性。血液學(xué)分析顯示，包括PBS、PPE或CAEN在內(nèi)的不同治療組小鼠的紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)和血小板(PLT)水平保持在正常范圍內(nèi)（見圖6D-F）。