“肝”不動了？肝臟疾病的發展竟然這么多學問？一文講清關于肝臟疾病的造模方法。

人類肝癌的發生通常繼發于慢性肝病 (Chronic liver disease, CLD)，如酒精性脂肪性肝病 (Alcohol-related fatty liver disease, AFLD) 和非酒精性脂肪性肝病 (Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)。AFLD 和 NAFLD 二者有相似的病理譜，慢性病理性損傷可導致過度纖維化、肝硬化并最終導致肝細胞癌 (Hepatocellular carcinoma, HCC)[1]。

? 酒精性肝病模型

酒精對酒精性肝病 (ALD) 的發生和進展的影響與飲酒的量和持續時間成正比[2]。研究慢性酒精濫用的動物模型是 Lieber-DeCarli 液體飲食模型、灌胃乙醇模型和飲用水酒精模型[2]。

Lieber-DeCarli 液體飲食法是將酒精加入液體飲食中來喂養，研究者可以根據需求進行營養元素的調整。動物除了含有乙醇的液體飼料外沒有任何食物或飲料。這種造模方法會導致早期肝損傷，不會發展到 ALD 的最嚴重階段。

灌胃乙醇輸注模型是將酒精直接注射到胃中。該模型可以維持高血液酒精濃度，并產生顯著的肝損傷。然而，這種造模方法較昂貴，對實驗操作人員的技能有嚴格要求。

飲用水中的酒精模型地模擬了依賴酒精的人類飲酒模式，操作簡單，目前被廣泛應用，并且可以與其他輔助因子 (如鐵、高脂飲食、維生素補充、LPS 注射) 誘導其他進行性肝病[4]。

酒精處理小鼠或對照小鼠的肝臟，以及酒精處理小鼠或對照小鼠的 HE 染色和油紅 0 染色肝臟切片。

? NAFLD 模型
NAFLD，非酒精性脂肪性肝病，是指沒有酒精濫用史的患者肝臟中脂肪堆積過多的一種疾病。NAFLD 分為單純性脂肪變性和非酒精性脂肪性肝炎 (Nonalcoholic steatohepatitis，NASH)。目前，基因模型、飲食模型、化學模型等已被廣泛用于 NAFLD 的臨床前研究中[5][6]。

在 NASH 中，不僅存在脂肪變性還存在小葉內炎癥和肝細胞球囊化，常伴有進行性纖維化。長期存在的 NASH 可能發展為肝硬化，肝細胞癌。飲食模型是 NASH 研究中常用模型。C57BL/6 小鼠、Wistar 大鼠和 Sprague Dawley 大鼠由于其固有的肥胖、DM2 和 NAFLD 傾向而作為 NAFLD/NASH 造模的模式動物。發病時間以及伴隨代謝特征的程度取決于物種、品系、性別、腸道微生物群的組成以及所采用的飲食干預[5]。

表 1. 常用的飲食模型^[5][8]。

? 肝纖維化及晚期肝病模型

肝纖維化的主要原因包括酗酒、慢性肝炎病毒感染和非酒精性脂肪性肝炎，可發展為肝硬化甚至肝細胞癌 (HCC)。利用化學手段進行肝纖維化及晚期肝病誘導是目前臨床前研究的常用模型。化學藥物進入肝細胞產生毒性代謝物，引起肝持續損傷，誘導肝臟疾病的發生。乙醇、 (CCl₄)、硫代乙酰胺 (TAA)、二甲基亞硝胺 (DMN)、二乙基亞硝胺 (DEN) 等肝臟毒素是常用的化學誘導劑[8]。在大多數情況下，腹腔注射這些化學物質會在相對短期內引發肝纖維化；口服或者吸入會需要更長的發展周期。

CCl₄ 是嚙齒類動物肝纖維化和肝硬化研究中應用泛的肝毒素，其造成的損傷類似于人類肝纖維化的重要特性，包括炎癥、再生和纖維形成，常用于研究急性肝損傷、晚期肝纖維化及纖維化逆轉。CCl₄ 模型適用于大鼠和小鼠，但小鼠由于CCl₄ 代謝率更高成為造模的。小鼠對 CCl₄ 誘導的肝纖維化的易感性是菌株依賴性的，與 C57BL/6 和 DBA/2 相比，BALB/c 小鼠在 CCl₄ 給藥后表現出更多的肝纖維化病理特征[9]。CCl₄ 誘導的肝纖維化模型具有很高的可重復性，因此是藥物篩選的候選者。

表 2. 常見化學誘導肝臟疾病模型。 

DEN 是一種基因毒性致癌物，被廣泛用于誘導嚙齒動物 HCC。單次 DEN 的 HCC 形成時間不僅與劑量有關，還與年齡、性別和遺傳背景等因素有關。研究表明，雌性小鼠對 DEN 驅動的肝癌發生具有很大的抵抗力[18]。當小鼠長期反復暴露于 DEN 時，的雄性小鼠而只有 30% 的雌性小鼠發生肝臟腫瘤。與成年小鼠相比，幼齡小鼠的 HCC 誘導率更高。對于不能通過單一 DEN 誘導 HCC 的成年小鼠，需要使用其他腫瘤促進劑，如 (CCl₄)、和高脂肪飲食喂養[19]。此外，DEN 與 CCl₄ 聯合誘導可改善傳統化學誘導耗時較長的缺點，而且更好地模擬了人類肝癌的發展過程。

當然，除了以上不同發展階段肝臟疾病的常見造模方法，手術、轉基因、免疫、飲食與化學手段聯用等手段也可用于肝臟疾病造模[8][9]。例如，膽總管結扎術 (BDL) 可引起膽汁淤積性損傷和門靜脈周圍膽道纖維化；CCl₄ 可以增強 HFD 對 NASH 和纖維化的發展進程；4 ~ 6 月齡 Mdr2 缺陷小鼠可發生 HCC。大家可以結合參考文獻，根據自己的實驗目的選擇合適的造模方法喔~

Carbon tetrachloride  通過交感神經通路誘導急性肝損傷。引起肝纖維化和肝毒性，廣泛用于肝臟疾病造模。

Thioacetamide，TAA 一種間接的肝毒素，可引起實質細胞壞死。

Dimethylnitrosamine，DMN  一種強效的肝毒素、致癌劑和誘變劑。

N-Nitrosodiethylamine，DEN 一種有效的致癌物質二烷基硝胺。

?Aflatoxin B1?， 一類 1A 級致癌物質，是 Aspergillus flavus 和 A. parasiticus 的次生代謝產物。

MCE的所有產品僅用作科學研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產品和服務。

參考文獻：
[1] Carlessi R, et al. Mouse Models of Hepatocellular Carcinoma. In: Tirnitz-Parker JEE, editor. Hepatocellular Carcinoma [Internet]. Brisbane (AU): Codon Publications; 2019 Oct 24. Chapter 4.
[2] Tan P, et al. Establishment of an alcoholic fatty liver disease model in mice. Am J Drug Alcohol Abuse. 2017 Jan;43(1):61-68.
[3] Tsukamoto H, et al. Insights into the pathogenesis of alcoholic liver necrosis and fibrosis: status report. Hepatology. 1990 Sep;12(3 Pt 1):599-608. 
[4] Brandon-Warner E, et al. Rodent models of alcoholic liver disease: of mice and men. Alcohol. 2012;46(8):715-725.
[5] Van Herck MA, et al. Animal Models of Nonalcoholic Fatty Liver Disease-A Starter's Guide. Nutrients. 2017;9(10):1072.
[6] Takahashi Y, et al. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis. World J Gastroenterol. 2012;18(19):2300-2308.
[7] Oligschlaeger Y, et al. NAFLD Preclinical Models: More than a Handful, Less of a Concern? Biomedicines. 2020 Feb 8;8(2):28.
[8] Wu S,et al. An update on animal models of liver fibrosis. Front Med (Lausanne). 2023 Mar 23;10:1160053.
[9] Yanguas SC, et al. Experimental models of liver fibrosis. Arch Toxicol. 2016 May;90(5):1025-1048.
[10] Zhang L, et al. Mangiferin relieves CCl4-induced liver fibrosis in mice. Sci Rep. 2023 Mar 13;13(1):4172.
[11] Lin CY, et al. Establishment of a Rat Model of Alcoholic Liver Fibrosis with Simulated Human Drinking Patterns and Low-Dose Chemical Stimulation. Biomolecules. 2023 Aug 24;13(9):1293.
[12] Farouk K. et al. Therapeutic Effect of Dunaliella salina Microalgae on Thioacetamide- (TAA-) Induced Hepatic Liver Fibrosis in Rats: Role of TGF-β and MMP9. BioMed Research International. 2019  
[13] Chandrashekar DV, et al. Effects of chronic cirrhosis induced by intraperitoneal thioacetamide injection on the protein content and Michaelis-Menten kinetics of cytochrome P450 enzymes in the rat liver microsomes. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2023 Feb;132(2):197-210.
[14] Fukawa A, et al. Bovine milk-derived α-lactalbumin prevents hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine via nitric oxide pathway in rats. Biosci Biotechnol Biochem. 2017 Oct;81(10):1941-1947.
[15] Jézéquel AM, et al. Dimethylnitrosamine-induced cirrhosis. Evidence for an immunological mechanism. J Hepatol. 1989 Jan;8(1):42-52.
[16] Sladky VC, et al. PIDDosome-induced p53-dependent ploidy restriction facilitates hepatocarcinogenesis. EMBO Rep. 2020 Dec 3;21(12):e50893.
[17] Tripathy A, et al. The molecular connection of histopathological heterogeneity in hepatocellular carcinoma: A role of Wnt and Hedgehog signaling pathways. PLoS One. 2018 Dec 4;13(12):e0208194.
[18] Tolba R, et al. Diethylnitrosamine (DEN)-induced carcinogenic liver injury in mice. Lab Anim. 2015 Apr;49(1 Suppl):59-69.
[19] Zheng HC, et al. An overview of mouse models of hepatocellular carcinoma. Infect Agent Cancer. 2023 Sep 5;18(1):49.