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每當凜冬來臨，各種病毒病原體愈發蠢蠢欲動，走了新冠病毒來了支原體，時不時甲流乙流也來發動助攻。當下使用智能手表檢測心率、血氧飽和度等已經非常普及，那么有沒有更好的方式能夠及時發現來襲的各種討厭的病毒呢？放心，來自全球各地的科學家正在火熱的研究各種新鮮好玩的可穿戴傳感器。
大家可能想不到，在這樣一個揉合了多學科的好玩前沿領域中，名不見經傳的多功能酶標儀（學名多功能微孔板檢測儀），究竟能發揮什么樣的作用呢？接下來，就讓我們圍觀一下來自全球高端玩家的玩機指南吧！
無細胞冷凍干燥可穿戴技術（wFDCF）
來自哈佛大學Wyss生物啟發工程研究所和麻省理工學院的研究人員開發了一種基于 CRISPR 技術的可穿戴的合成生物學傳生物感器，在無需引入活工程細菌的情況下，只需簡單的水溶液暴露，即可激活該生物傳感器（wearable freeze-dried, cell-free, wFDCF），從而用以檢測環境中的病原體和毒素，并發出熒光信號報告。更棒的是，研究團隊還將這一技術集成到了標準口罩中，以檢測患者呼吸中，以及空氣中是否存在 SARS-CoV-2 病毒，該技術的檢測限可以與目前的實驗室方法（例如 qPCR）相媲美。
在這項研究種，Agilent BioTek 的 SynergyNEO HTS 多功能酶標儀主要用于適配 wFDCF 傳感器的紡織物材料的高通量篩選，以及驗證基于 CRISPR 的 wFDCF 傳感器用于 RNA 直接檢測的有效性這兩方面。
SnynergyNEO 開展紡織品中 FDCF 合成生物學反應的高通量篩選
研究團隊最初設計了一種基于比色法信號輸出的 wFDCF 傳感器，由三層皮膚安全材料制成的有機硅彈性體逐層組裝而成，FDCF 反應傳感器嵌入其中，組裝好的傳感器具有合適的彈性和柔韌性以支持可穿戴設計。液態樣本在最上層的入口進入后通過毛細管作用快速進入反應室。合成生物學的電路傳感器輸出采用 LacZ β-半乳糖苷酶操縱子，其能夠水解氯酚紅-β-d-半乳糖苷（CPRG），當暴露于靶標后會發生黃到紫色的變化。通過這樣的巧妙設計，研究團隊測試了不同的傳感器模型，用于檢測小分子或病毒 RNA（圖 1）。
圖 1：比色法信號輸出的 wFDCF 傳感器設計示意圖
隨后，研究團隊深入繼續深入該傳感器的檢測靈敏度和適用范圍，將其應用于日常穿戴的紡織物中，并開發基于熒光檢測信號輸出的檢測體系，此項工作的第一步，便是篩選出更加適合的 FDCF 傳感器紡織品載體。
篩選實驗流程簡介
1 先將 103 種織物樣本預處理，包括去除顆粒、洗滌等，每種織物分為 BSA 封閉處理和未處理兩組，干燥處理后用打孔器制成 2mm 的樣本，每個樣本設置三個重復，移入 384 孔板底部，對照組選擇 Whatman No.4 號濾紙。
2 隨后每孔內加入等量的包含 0.6mg/mL CPRG 的定制 LacZ 模板的 PURExpress 游離體外蛋白合成液，微孔板密封留孔后整板凍干。
3 凍干后的紡織物待測板子加入 ddH2O 水化至初始反應體積。
4 使用 SynergyNEO 微孔板檢測儀在 37℃ 的條件下，對樣本 384 孔板進行長達 12 小時的動態比色反應（OD420nm）檢測，用于評價每種紡織物的 FDCF 傳感器的合成生物學反應效果。
數據處理和篩選結果
動力學顯色反應結束后在微孔板中可觀察到明顯的顯色反應變化，SynergyNEO 和 Gen5 軟件能夠自動生成每個樣本的動力學數據結果，用戶后續的參數統計和分析（圖 2）。通過 OD420 峰值吸收光強度、動力學平均反應速率、到達最大信號時間、滯后時間（LagTime）等動力學參數聯合紡織物密度和自發熒光等參數，設計了篩選評分，最后研究團隊選擇了使用 85% 的聚酯纖維和 15% 的聚酰胺纖維的織物用于后續的熒光和發光信號輸出傳感器的載體（圖 3）。
圖 2：SynergyNEO 用于篩選 FDCF 適配的紡織物結果
圖 3：wFDCF 比色紡織品篩選的歸一化功能評分結果
SynergyNEO 驗證 CRISPR-wFDCF 用于 RNA 直接檢測的有效性
CRISPR 技術用于基因編輯領域已經是非常成熟和熱門的技術，除了基因編輯，這項技術在分子檢測領域也是大放異彩，早在 COVID-19 爆發不久，CRISPR 領域大神華人科學家張鋒于 2020 年發表了使用 CRISPR 診斷工具檢測新型冠狀病毒 COVID-19 的 SHERLOCK 技術，詳細介紹了標本提取和檢測的方案。隨后，馬薩諸塞州劍橋市的夏洛克生物科學公司（Sherlock Biosciences）獲得了美國食品和藥物管理局 (FDA) 的緊急使用授權 (EUA)，用于檢測導致 COVID-19 的病毒的 SHERLOCK CRISPR SARS-CoV-2 試劑盒，這是 FDA 首次授權使用 CRISPR 技術。安捷倫的 BioTek SynergyNeo2 是當時市場上唯一被批準用于 SHERLOCK SARS-CoV-2 診斷測試的微孔板讀板機。
由于 SHERLOCK 技術具有靈敏度高，響應速度快、單堿基對分辨率、凍干兼容性和面向任意 DNA/RNA 序列的可編程性等諸多優點，該研究團隊將此技術融入到 wFDCF 的設計中，研究團隊開發了一種可以檢測呼出氣溶膠中 SARS-CoV-2 的口罩，只需按下病毒外側的按鈕，啟動傳感器內三種不同的生物反應，第一種反應用于破壞新冠病毒的蛋白外殼，暴露其內部的 RNA；第二個反應是一個常溫 PCR 擴增步驟，特異性擴增新冠病毒的刺突蛋白 （S 蛋白） 的基因片段；最后第三個反應使用基于 CRISPR-Cas13a 的 SHERLOCK 技術來檢測病毒的 S 基因，被激活的 Cas13a 將熒光-DNA 探針分子切成兩個更小的片段，在口罩內部的 LAF 窗口會顯示出肉眼可見的條帶（圖 4）。
除此之外，研究團隊還繼續開發了光纖網絡集成的 wFCDF 傳感器，能夠產生更客觀可靠的熒光數據信號，可以通過智能手機的 APP 實時查看該信號。
圖 4：口罩式用于檢測 SARS-Cov-2 的集成化可穿戴設備設計
為了驗證這種融合了 SHERLOCK 技術的 wFDCF 的有效性，使用 SynergyNEO 測試了 CRISPR-Cas13a 系統直接檢測病毒 RNA 的效果。
檢測流程簡介
1 制備 A CRISPR-Cas13a-MRSA SHERLOCK RNA 紡織品冷凍干燥樣本：反應體系包含可以被 Cas13a 切割的熒光探針底物 RNaseAlert，按前述操作轉入微孔板中并進行冷凍干燥。
2 使用含有 20nM mecA RNA transcript trigger 的 ddH2O 水化處理微孔板中的冷凍干燥的紡織品生物傳感器。
3 將微孔板置入 SynergyNEO 中，在 30℃ 條件檢測熒光信號的動力學變化 (Ex. 470 nm/Em. 528nm, 30mins)。
4 微孔板檢測結果和可穿戴設備的熒光顯色反應進行平行對比。
檢測結果分析
對可穿戴設備的熒光顯色成像結果的信號強度做均一化處理后，其動力學曲線（圖 5 綠色曲線）和微孔板熒光強度曲線（圖 5 紅色曲線）一致，此結果提示基于此 Cas13a 酶體系的 wFCDF 傳感器的可穿戴設備平臺具有良好的病毒 RNA 檢測效果，除此。
圖 5：wFDCF CRISPR-Cas13a 生物傳感器直接檢測 RNA 的效果驗證
SynergyNeo2 多功能微孔板檢測儀推薦
SynergyNeo2 是安捷倫微孔板檢測家族中的頂級旗艦款，不僅融合了 Synergy 家族獨特的 Hybrid 技術，具有獨立的光路，確保在所有檢測模式下均能獲得出色的性能。此外其配備帶寬連續可調的第四代四光柵系統，并搭載基于雙平行 PMT 檢測的超快速高靈敏濾光片光學模塊，并且支持 TRF 激光器檢測和 Alpha 激光器檢測。
SynergyNeo2 主要優勢
檢測模式全面，包含連續波長吸收光、熒光強度檢測、化學發光檢測、FP、TRF、HTRF、TR-FRET、FRET、BRET、AlphaLISA 和 alphasgreen 檢測模式。
獨特Hybrid 光路：卓越的檢測性能保證
超快速：最高可配置 4 個 PMT 用于超快測量
輔助檢測功能豐富：包含先進的環境控制技術，溫控至 70°C（這項功能在包括本文提到的 SHERLOCK 在內的恒溫 PCR 技術中非常重要）和變速振蕩，以支持活細胞分析。
自動化對接友好：BioStack Neo 可提供無人值守的自動化功能、高通量和條形碼標記的濾光片模塊，可以簡化工作流程和降低出錯率。
軟件功能強大：Gen6 軟件提供了全面的微孔板檢測儀控制、強大的數據分析功能和 LIMS 集成功能。
應用范圍廣泛：涵蓋基礎研究到藥物發現的多個領域應用。
參考文獻
1. Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection. https://doi.org/10.1038/s41587-021-00950-3
2. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. https://www.nature.com/articles/s41596-019-0210-2
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