熒光探針是潛在的熒光團，可根據生物微環境變化、與被分析物相互作用或特定化學反應顯示熒光信號。由于其具有操作簡單、選擇性好、靈敏度高、檢測范圍廣、響應速度快以及對樣品損傷小等優點，已經被成功應用于生物醫學、生命科學及環境科學等領域。

鈣離子熒光探針：

鈣（Calcium）是一種重要的且普遍存在的第二信使，參與調控各種各樣的細胞過程，包括細胞增殖、基因轉錄、肌肉收縮和胞吞作用。響應于大量的刺激物，鈣離子（Ca2⁺）從胞內的儲存池釋放出來，而胞內Ca2⁺濃度的增加會引起細胞功能的活化、調節和終止。許多泵和離子通道都允許這種陽離子進入和離開細胞，并且在細胞質和胞內蓄池間移動。

圖 CaSR（鈣感應受體）在高葡萄糖處理的心臟成纖維細胞激活中的作用示意圖^[1]

Fluo 3-AM是常用的檢測細胞內鈣離子濃度的熒光探針之一。它穿透細胞膜進入細胞后被細胞內的酯酶剪切形成Fluo-3，從而被滯留在細胞內，Fluo-3若以游離配體形式存在時幾乎是非熒光性的，但是當它與細胞內鈣離子結合后可以產生較強的熒光，最大激發波長為506nm，最大發射波長為526nm。實際檢測時推薦使用的激發波長為488nm左右，發射波長為525～530nm。可以使用激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀檢測細胞內鈣離子濃度的變化。Fluo 4-AM是Ca²⁺熒光探針Fluo 3-AM的改良版本。

Fluo 4-AM相比較于Fluo 3-AM的優勢：

1）激發和發射波長往短波長偏移10nm，更接近氬激光器的波長，因此，當使用488nm進行熒光激發，得到更強的熒光信號，比Fluo-3強一倍；
2）50μg小包裝供應，使用方便，且能很好保證產品的穩定性。

圖 用Fluo 3-AM對胞漿Ca²⁺進行染色，并通過檢測熒光強度進行評估^[1]

活性氧（ROS）探針：

活性氧類物質（Activated oxygen species，AOS），又稱反應性氧類物質（Reactive oxygen species，ROS），體內的各種生理和病理過程都能生成。ROS的生理效應通過與大量易氧化的胞內物質反應來發揮，這些物質包括NADH、NADPH、抗壞血酸、組胺、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、蛋白質和核酸。ROS還能氧化膽固醇和不飽和脂肪酸，引起膜脂質氧化。

2′,7′-二氯二氫代熒光黃二醋酸（2′,7′-Dichlorofluorescin Diacetate, DCFH-DA），是一種通用的氧化應激指示劑。可滲透細胞膜，本身無熒光。一旦進入細胞后，被細胞酯酶水解生成2′,7′-二氯二氫熒光素（DCDHF）并進一步被氧化生成強熒光的2′,7′-二氯熒光素（DHF）。DCFH-DA與細胞內氧化應激產生的多種活性氧都有反應，包括過氧化氫（H₂O₂）、過氧基（ROO•）和過氧亞硝基陰離子（ONOO^-）。DCFH-DA常用來監測細胞氧化還原過程。二氫羅丹明123（DHR123）是DCDHF的類似物，具有親脂性，通過細胞膜擴散。存在活性氧物質的情況下，細胞內的二氫羅丹明123氧化為熒光R123，定位在線粒體中。

圖 DCFH-DA探針監測癌細胞內活性氧的產生^[2]

硫化氫（H₂S）熒光探針：

硫化氫（H₂S）是繼一氧化碳和一氧化氮之后，第三種可在生命體內發揮生理作用的內源性氣體信號分子。該氣體分子在心血管和神經系統中擔負著重要的生理病理調節作用。在生物檢測技術手段中，熒光探針法具有選擇性好、靈敏度高、對生物樣品損傷小以及可實現實時原位檢測等優勢，故應用熒光探針法檢測細胞內H₂S濃度的變化是近年來研究熱點之一。

WSP-1（Washing State Probe-1）是一種含活性二硫化物的熒光探針，用來檢測生物樣本和細胞內的H₂S。通過基于反應的熒光開啟策略，WSP-1選擇性且快速與H₂S反應，生成苯丙二硫醇酮（benzodithiolone）和一種熒光化合物（見圖1）。WSP-5（Washing State Probe-5）也是一種H₂S熒光探針，WSP-5與WSP-1相比，其靶向H₂S表現出更快的熒光開啟速率和更靈敏的檢測限。

圖 WSP-1檢測H₂S反應機制^[3]

應用實例：

圖 用WSP-1對植物細胞進行內源性H₂S的示蹤和熒光成像檢測^[4]

圖 用WSP-5對SHSY5Y和U87MG細胞進行H₂S熒光顯微鏡成像檢測^[5]

熒光探針不僅可以檢測陽離子和陰離子，還可以檢測活性氧及硫化氫等小分子化合物。近年來檢測生物酶和細菌等生物活性物質的熒光探針也越來越多。值得一提的是，由于部分熒光探針具有良好的生物相容性、高靈敏度、無創性、穩定的發射特性和實時成像等優點，使得基于熒光探針的生物成像技術發展迅速，現在已成為可視化多種生理和病理過程的有力工具。

[1] Yuan H , Fan Y , Wang Y , et al. Calcium-sensing receptor promotes high glucose-induced myocardial fibrosis via upregulation of the TGF-beta(1)/Smads pathway in cardiac fibroblasts[J]. Nature reviews neuroscience,2019(2):20.
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[3] Liu C ,  Pan J ,  Li S , et al. Capture and Visualization of Hydrogen Sulfide by a Fluorescent Probe[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2011, 50(44).
[4] Li Y J ,  Chen J ,  Xian M , et al. In Site Bioimaging of Hydrogen Sulfide Uncovers Its Pivotal Role in Regulating Nitric Oxide-Induced Lateral Root Formation[J]. Plos One, 2014, 9(6):e90340.
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