四環素類檢測試劑盒使用說明書

（酶聯免疫法）

1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測組織、蜂蜜、雞蛋等樣本中的四環素類藥物（Tetracyclines，TCs），試劑盒由預包被偶聯抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的四環素類藥物和酶標板上預包被偶聯抗原競爭抗四環素類藥物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含四環素類藥物含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中四環素類藥物的殘留量。

2 技術指標

2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb(ng/ml)

2.2 反應模式：37℃，30min～30min～15min

2.3 檢測下限：

組織、肝臟、雞蛋…………………2ppb

蜂蜜…………………………………2ppb

尿樣………………………………0.5ppb

牛奶…………………………………2ppb

奶粉…………………………………4ppb

2.4 交叉反應率：

四環素………………………………100%

土霉素………………………………107%

金霉素………………………………16.7%

強力霉素……………………………4.2%

 2.5 樣本回收率：

組織、肝臟、雞蛋…………75±20%

蜂蜜…………………………80±20%

尿樣…………………………80±20%

牛奶、奶粉…………………75±20%

3 試劑盒組成

酶標板………………………96孔

高濃度標準品溶液1瓶：（1ml/瓶）1.0ppm（高標準液有揮發性，需注意密封）

標準品溶液0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb（均為空瓶子，現配現用）。

酶標記物（紅蓋）……………………11ml

抗體工作液（藍蓋）…………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

5×復溶液（黃蓋） …………………50ml

說明書…………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個

4 需要的器材和試劑  四環素類檢測試劑盒使用說明書

4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：濃鹽酸、無水甲醇

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結果。

5.2 配液：

配液1：復溶液

將5×復溶液用去離子水5倍稀釋（1份5×復溶液加4份去離子水），用于樣本的復溶，復溶液在4℃環境可保存一個月。

配液2：工作洗滌液

    將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。配液3：樣本提取液

取4.3mL濃鹽酸加去離子水混勻，定容至50mL，再加入450ml無水甲醇。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 組織、肝臟、雞蛋樣本處理方法

1）準確稱取1±0.05g均質后的樣本于離心管中，加入2ml 樣本提取液（配液3），劇烈振蕩2min，使樣本分散，充分與有機相接觸，室溫4000轉/分以上，離心5min；

2）取出50ul上層液體（樣本脂肪多最上層會有白色漂浮物，不要取到）,加入950ul復溶液混勻；

3）取50 µl用于分析。

    樣本稀釋倍數：40    檢測下限：2ppb

5.3.2 蜂蜜樣本處理方法

1）準確稱取1±0.05g蜂蜜樣本于離心管中，加入1ml樣本提取液（配液3），振蕩混勻2min，使蜂蜜充分溶解；

2）取出50ul混合液,加入950ul復溶液混勻；

3）取50µl用于分析。

    樣本稀釋倍數：40    檢測下限：2ppb

5.3.3 尿樣本的處理方法

1）用復溶液將尿樣10倍稀釋（如果尿樣渾濁一定要過濾或離心10min，4000r/min，直至得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應冷凍保存。

2）取50µl稀釋的尿樣用于分析。

    樣本稀釋倍數：10    檢測下限：0.5ppb

5.3.4 牛奶樣本處理方法

1）準確吸取1ml牛奶于離心管中， 加2ml樣本提取液（配液3），振蕩2min，室溫4000轉/分以上，離心5min；

2）取50ul上層液，加入950ul復溶液，混勻；

3）取50µl用于分析。

樣本稀釋倍數：40    檢測下限：2ppb

5.3.5 奶粉樣本處理方法

1）準確稱取1±0.05g奶粉于離心管中，加入4ml樣本提取液（配液3），振蕩2min，室溫4000轉/分以上，離心5min；

2）取50ul上層液，加入950ul復溶液，混勻；

3）取50µl用于分析。

    樣本稀釋倍數：80    檢測下限：4ppb

6 酶聯免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實驗開始前需配制標準品應用液；低濃度的標準品不穩定，需現配現用。

在0ppb的瓶中加復溶液3ml，0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb的瓶中分別加復溶液2ml，4.05ppb的瓶中加復溶液3ml。

標準液6：取1.0ppm高濃度標準品溶液12ul加入裝有3ml 復溶液4.05ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為4.05ppb。

標準液5：取1ml標準液6加入裝有2ml 復溶液1.35ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為1.35ppb。

標準液4：取1ml標準液5加入裝有2ml 復溶液0.45ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.45ppb。

標準液3：取1ml標準液4加入裝有2ml 復溶液0.15ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.15ppb。

標準液2：取1ml標準液3加入裝有2ml 復溶液0.05ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.05ppb。

標準液1：直接使用復溶液，濃度即為0ppb。四環素類檢測試劑盒使用說明書

6.1 編    號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應：加標準品應用液或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光反應30分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復洗滌5次，最后一次拍干。（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 加酶反應：加酶標記物100µl/孔，37℃避光反應30分鐘。

6.5 洗    滌：同上

6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光顯色15分鐘（若藍色過淺，可適當延長反應時間）。

6.7 終    止：加終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，終止反應。

6.8 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應在終止反應后10分鐘內完成。

7 結果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值

7.2 標準曲線的繪制與計算

    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準液的半對數曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）

8 注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要，在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。

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