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免疫熒光標記法

來源:蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司   2023年11月22日 17:19  

免疫熒光標記法

1、細胞膜上的免疫熒光檢測法

間接標記法

1)    制備單細胞懸液;

2)    細胞計數(shù),取出  106 個細胞于試管中;

3)   用臺盼藍染色計活細胞數(shù),要求活細胞數(shù) >90  95%

4)   在試管中加入一抗,(劑量按照說明書的要求),孵育 30  60 分鐘;

5)    PBS 洗滌 1  2 次, 1500rpm,離心 3 分鐘,棄上清;

6)   加入二抗,孵育 20  30 分鐘;

7)   PBS 洗一次, 1500rpm,離心 3 分鐘,棄上清;

8)    300μl PBS,上機檢測(若不能及時上機檢測, 可加 1ml 1%多聚甲醛固 定,可放置 1 )

直接標記法

 ~ 同間接標記法

在試管中加入熒光標記的抗體,混勻,孵育 30 分鐘;

 PBS  2 次, 1500rpm,離心 3 鐘,棄上清;

 300μl PBS(PH=7.4),上機檢測。

2 細胞膜內的免疫熒光標記法

間接免疫熒光標記法

1)   取已制備好的單細胞懸液,用 1  3%的多聚甲醛固定 30 分鐘(也可 4 保存過夜 );

2)     PBS 洗兩次,棄上清;

3)    細胞膜打孔,加入 0.1%皂素 200μl,室溫 10 分鐘;

4)     PBS 洗滌兩次;

5)   加入第一抗體, 室溫 30  60 分鐘, 4過夜, 同時須設陰性對照或同 型對照管;

6)     PBS 洗滌兩次;

7)   加入二抗(熒光標記的抗體)室溫 20 分鐘,避光;

8)     PBS 洗滌 1  2 次,棄上清;


9)    重懸細胞于 500μlPBS 中,上機檢測。

直接熒光標記法

 ~ 同間接熒光標記法;

加入熒光素標記好的抗體,避光 30 分鐘(同時做同型對照管);

 PBS 洗滌1~2次,棄上清;

 300μl PBS 上機檢測。

細胞膜上及細胞內雙標記法( 直標法)

1)   取出已制備好的未固定的單細胞懸液  10 6 個細胞于試管中; 2)     PBS 洗滌兩次;

3)   加入用熒光素標記的抗體來標記細胞膜上的抗原, 同時加上陰性對照管, 室溫孵育 20 分鐘;

4)   在試管中加入 1%~3%多聚甲醛 1ml,固定 30 分鐘;

5)   PBS 洗滌兩次 1500rpm 3 分鐘,棄上清;

6)   打孔,加入 0.1%皂素 200μl 室溫 10 分鐘;

7)    PBS 洗滌兩次,棄上清;

8)   加入用熒光素標記的抗體,標記膜內的抗原(標記膜內的抗體的熒光素

的顏色與膜上標記的熒光素的顏色務必不相同)室溫 20 分鐘孵育;

9)     PBS 洗一遍棄上清;

10)  300μlPBS 重懸細胞,上機檢測

五、流式細胞術中的幾點注意事項:

1 、對照組的設置:

在流式細胞術中所測得的量都是相對值,不是絕對值。如需知道絕對值

時必須設置對照組樣品。對照組樣品包括有陰性對照和陽性對照。

 1 )、陰性對照的設置

2 在實驗過程中,如做間接標記法,可設置與一抗無關的實驗,即在 實驗中不加一抗而只加上帶有熒光標記的第二抗體作為陰性對照

管,作為陰性對照。

2 在實驗過程中,假設做直接標記法,可設置理論上的陰性細胞作為  陰性對照管, 實驗過程及步驟與實驗組務必相同。(做間接標記法時 

同樣也可同時設置 陰性細胞 的陰性對照管作為陰性對照。

2 在實驗過程中,假設做直接標記法,可將實驗組細胞,取一管,加

上與實驗抗體所標記的熒光顏色相同的同型對照來作為陰性對照。 

2)、陽性對照的設置:

在實驗過程中如涉及到表達缺失或減少的實驗,應設置陽性對照組,其設置方法與陰性對照設置相同。

2、幾點建議:

1)   在實驗過程中, 在保證實驗的科學性和準確性的基礎上, 應盡量減少實驗工 序和過程。由于間接標記法的工序多,實驗過程長, 如再加之操作的不熟練  細胞更容易丟失和受損, 而造成實驗結果的誤差。因此,在條件允許的范圍 內, 建議盡量做直接標記法而不去做間接標記法, 以保證實驗的真實性和準 確性。

2)    建議送檢細胞一定要足夠量, 一般要求  106 個細胞。不要過少。因為,如 細胞太少檢測時樣本流量相對會增大從而影響變異系數(shù), 結果也不可信。  胞量也不宜過多, 因細胞量太多加入的抗體或染料相對不足, 結果也由此受

影響。

3) 同一種細胞需同時做雙標記時, 須做雙標記的同型對照 且兩種抗體所標記 的熒光顏色務必不同。


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