免疫熒光標記法
1) 制備單細胞懸液;
2) 細胞計數(shù),取出 1× 106 個細胞于試管中;
3) 用臺盼藍染色計活細胞數(shù),要求活細胞數(shù) >90 ~ 95%;
4) 在試管中加入一抗,(劑量按照說明書的要求),孵育 30 ~ 60 分鐘;
5) PBS 洗滌 1 ~ 2 次, 1500rpm,離心 3 分鐘,棄上清;
7) PBS 洗一次, 1500rpm,離心 3 分鐘,棄上清;
8) 加 300μl PBS,上機檢測(若不能及時上機檢測, 可加 1ml 1%多聚甲醛固 定,可放置 1 周)。
① ~ ③同間接標記法
④在試管中加入熒光標記的抗體,混勻,孵育 30 分鐘;
⑤用 PBS 洗 2 次, 1500rpm,離心 3 分鐘,棄上清;
1) 取已制備好的單細胞懸液,用 1 ~ 3%的多聚甲醛固定 30 分鐘(也可 4℃ 保存過夜 );
3) 細胞膜打孔,加入 0.1%皂素 200μl,室溫 10 分鐘;
5) 加入第一抗體, 室溫 30 ~ 60 分鐘,或 4℃過夜, 同時須設陰性對照或同 型對照管;
6) 用 PBS 洗滌兩次;
7) 加入二抗(熒光標記的抗體)室溫 20 分鐘,避光;
8) 用 PBS 洗滌 1 ~ 2 次,棄上清;
9) 重懸細胞于 500μlPBS 中,上機檢測。
加入熒光素標記好的抗體,避光 30 分鐘(同時做同型對照管);
用 PBS 洗滌1~2次,棄上清;
加 300μl PBS 上機檢測。
細胞膜上及細胞內雙標記法( 直標法)
1) 取出已制備好的未固定的單細胞懸液 1× 10 6 個細胞于試管中; 2) 用 PBS 洗滌兩次;
3) 加入用熒光素標記的抗體來標記細胞膜上的抗原, 同時加上陰性對照管, 室溫孵育 20 分鐘;
4) 在試管中加入 1%~3%多聚甲醛 1ml,固定 30 分鐘;
5) PBS 洗滌兩次 1500rpm 3 分鐘,棄上清;
6) 打孔,加入 0.1%皂素 200μl 室溫 10 分鐘;
7) 用 PBS 洗滌兩次,棄上清;
8) 加入用熒光素標記的抗體,標記膜內的抗原(標記膜內的抗體的熒光素
的顏色與膜上標記的熒光素的顏色務必不相同)室溫 20 分鐘孵育;
9) 用 PBS 洗一遍棄上清;
10) 用 300μlPBS 重懸細胞,上機檢測
五、流式細胞術中的幾點注意事項:
在流式細胞術中所測得的量都是相對值,不是絕對值。如需知道絕對值
時必須設置對照組樣品。對照組樣品包括有陰性對照和陽性對照。
2 在實驗過程中,如做間接標記法,可設置與一抗無關的實驗,即在 實驗中不加一抗而只加上帶有熒光標記的第二抗體作為陰性對照
管,作為陰性對照。
2 在實驗過程中,假設做直接標記法,可設置理論上的陰性細胞作為 陰性對照管, 實驗過程及步驟與實驗組務必相同。(做間接標記法時 ,
同樣也可同時設置“ 陰性細胞” 的陰性對照管作為陰性對照。
2 在實驗過程中,假設做直接標記法,可將實驗組細胞,取一管,加
上與實驗抗體所標記的熒光顏色相同的同型對照來作為陰性對照。
(2)、陽性對照的設置:
在實驗過程中如涉及到表達缺失或減少的實驗,應設置陽性對照組,其設置方法與陰性對照設置相同。
1) 在實驗過程中, 在保證實驗的科學性和準確性的基礎上, 應盡量減少實驗工 序和過程。由于間接標記法的工序多,實驗過程長, 如再加之操作的不熟練 , 細胞更容易丟失和受損, 而造成實驗結果的誤差。因此,在條件允許的范圍 內, 建議盡量做直接標記法而不去做間接標記法, 以保證實驗的真實性和準 確性。
2) 建議送檢細胞一定要足夠量, 一般要求 1× 106 個細胞。不要過少。因為,如 細胞太少檢測時樣本流量相對會增大從而影響變異系數(shù), 結果也不可信。 細 胞量也不宜過多, 因細胞量太多加入的抗體或染料相對不足, 結果也由此受
影響。
3) 同一種細胞需同時做雙標記時, 須做雙標記的同型對照, 且兩種抗體所標記 的熒光顏色務必不同。
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