近年來，生物大分子標記技術受到很大重視并取得了迅速進展，此技術廣泛應用于細胞內外物質的檢測、核酸雜交測序以及疾病診斷等諸多方面。抗體/蛋白的標記原理是標記試劑與抗體/蛋白所帶的巰基、氨基及羧基等基團發生置換或縮合反應連接在一起。抗體標記技術被廣泛用于醫學病理學、免疫組織化學、分子生物學等領域。本期小愛主要介紹3種常見的抗體標記技術：熒光素（FITC、PE、APC等）標記法、酶（辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）標記法和生物素（Biotin）標記法。

抗體/蛋白的異硫氰酸熒光素（FITC）標記法

異硫氰酸熒光素 ( Flourescein isothiocyanate，FITC) 是在熒光素的結構上引入異硫氰基( -N = C = S) 得到的，在堿性環境下，抗體的賴氨酸R氨基與FITC的硫碳胺鍵共價結合，形成牢固的抗體—FITC復合物（圖1），從而實現對目標分子的熒光標記。

圖1 FITC標記抗體原理

熒光試劑的種類不同，標記方法各有差別，但所要求的條件和步驟大致相同。影響標記的因素有溫度、MR 值及反應液中熒光試劑和免疫球蛋白的比例[1]。常用標記抗體的方法有攪拌法和透析法。方珍等[2]使用透析法對多克隆抗體進行標記。標記方法如下：

（1）取1 mg 抗體蛋白溶液，用pH9.0的碳酸鹽緩沖液對抗體溶液進行透析，使蛋白處于堿性環境。

（2）確定最佳反應比值：按照FITC與蛋白含量比值分別為1:20、1: 10、3: 20 計算 FITC 用量，逐滴加 入溶于DMSO的 FITC，室溫避光反應 4 h進行 FITC 標記。

（3）確定最佳標記抗體反應條件：確定FITC最佳用量后，按照反應條件為4℃、2 h；20℃、4 h；37℃、 30 min進行FITC標記。

（4）反應后液體用超濾離心管6 000 r/min 離心20 min，反復多次，收集每次離出液，測定熒光值 (F485/535)，直至離出液無熒光值。測定標記后F485/535值，結合顯著性差異分析實際情況，得到最佳FITC與抗體含量比值和反應條件。

抗體/蛋白的辣根過氧化物酶（HRP）標記

HRP標記抗體的原理其表面的糖分子被氧化成醛基，與抗體的氨基共價結合，形成HRP-抗體復合物。被HRP標記的抗體在特定酶與底物下，顏色發生變化，通過對其顏色的深淺進行抗原的定性、定量分析，被廣泛用于WB、ELISA、免疫組化等分析方法中。

制備辣根過氧化物酶( HRP) -抗體結合物的方法主要有戊二醛兩步法和過碘酸鈉法[3]。徐晶晶等[4]制備了兔源的M13KE多克隆抗體，將多克隆抗體經飽和硫酸銨法和Protein G Resin層析柱純化后運用過碘酸鈉法對其進行辣根過氧化物酶標記。標記方法如下：

（1）取4mg HRP溶于1 mL去離子水中。

（2）加入400 μL新制備的0.1 mol /L過碘酸鈉室溫振蕩20 min;

（3）將反應物于醋酸鈉緩沖液(0.001 mol /L，pH 4.4)中透析過夜；

（4）加入6 mg IgG，用0.2 mol /L碳酸鈉緩沖液( pH 9.5)調節溶液pH至9. 0~9.5，立即加入 200 μL新制備的5 mg /mL NaBH4 ，于4℃作用2 h。

（5）標記物純化：向制備好的酶結合物中緩慢滴加等體積的飽和硫酸銨，邊加邊攪拌，4℃沉淀30 min；5000 r/min 離心15 min，沉淀用適量的PBS溶解并加入等體積的甘油，-20℃保存，備用。

抗體/蛋白的生物素（Biotin-NHS）標記

生物素（D-Biotin），是一個分子量只有244.31Da的小分子，經活化后（Biotin-NHS）可與蛋白/抗體等生物大分子的氨基結合，不僅可以很好地保持大分子的生物活性，而且與親和素結合使用時具有多級放大作用，使其廣泛應用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究。

王雁云等[5]研究表明生物素標記人免疫球蛋白IgG 重鏈應有適當的比例，使被標記的生物素盡可能的多， 同時又避免過多的生物素造成空間位阻影響。該研究將生物素與人免疫球蛋白IgG 重鏈以各種不同的比例進行反應，然后與連接有抗人免疫球蛋白 IgG 重鏈抗體的微球顆粒反應，來評估生物素與待標記的人免疫球蛋白IgG重鏈反應的效價。標記方法如下：

（1） 取4 mg 純化的人免疫球蛋白 IgG 重鏈溶解于1 mL NaHCO3 (0.1 mol/L) 中；

（2）取5 mg生物素溶解于0.5 mL DMSO中，得到10 mg/mL 的生物素溶液；

（3）在已溶解有人免疫球蛋白 IgG 重鏈的溶液中，緩慢加入 100μL 已經制備好的生物素 DMSO 溶液， 室溫下讓人免疫球蛋白IgG重鏈與生物素反應1h，然后讓反應物過Sephadex G柱終止反應。

熒光素標記的抗體可以用來做流式細胞術FACS、IF、活體成像等標記示蹤類實驗；酶類標記的抗體可以直接和檢測底物反應，用于ELISA、WB、IHC等實驗；生物素標記的抗體可以再同酶聯親和素或酶聯Anti-Biotin 抗體反應，用于抗體的純化、測定微量抗原/抗體等。愛必信（上海）生物科技有限公司可以提供多種抗體產品以及抗體標記染料，同時可以提供蛋白/抗體標記服務，體系成熟，目前常規染料標記周期1-2周。

參考文獻：

[1]陳中舉,張燕玲,黃金瑛.熒光標記生物大分子及其應用[J].國外醫學.生物醫學工程分冊, 2004, 27(6): 348-352.

[2]方珍,鞠文,秦亞楠等.大腸桿菌O157:H7異硫氰酸熒光素標記抗體的制備及評價[J].吉林大學學報(醫學版), 2013, 39(1).

[3]孫凌霜,齊巖,王彬,等.鴨卵黃免疫球蛋白的提純及兔抗鴨IgY(H+L) HRP標記抗體的制備[J].中國獸醫雜志, 2007(1):10-12.

[4]徐晶晶,李迪,曹永生,等.辣根過氧化物酶標記兔抗絲狀噬菌體衣殼蛋白抗體的制備與初步應用[J].黑龍江畜牧獸醫, 2013(3):3.

[5]王雁云,張陽德.生物素標記人免疫球蛋白IgG重鏈的效果評估[J].中國現代醫學雜志, 2012, 22(12):3.

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