使用過液相的小伙伴應該都問過這樣的問題吧：不同的實驗應該選擇什么規格的色譜柱？如何提高色譜柱的分離？等等，今天就一起看看下面這些問題你都遇到過幾個？

1. 什么是反相柱、正相柱？

“反相”和“正相”的概念是液相色譜法早期提出的概念，當時鍵合相色譜柱尚未出現，固定相被涂覆在載體表面，極易流失，為此科學家對流動相使用給出了合理的建議：流動相極性與固定液極性應具有較大差別，以減少固定液流失。固定相極性弱于流動相時的液相色譜法被稱為反相色譜法，固定相極性強于流動相時的液相色譜法被稱為正相色譜法。盡管目前鍵合相色譜柱已成為主流，但這一概念在色譜方法開發、預測出峰順序等方面具有重要意義。

由上面的介紹可知具體的色譜方法、色譜柱屬于正相還是反相不僅取決于固定相極性，同時還取決于流動相極性。C18（硅膠鍵合十八烷基硅烷）、C8（硅膠鍵合辛基硅烷）、PH（硅膠鍵合苯基硅烷）等色譜柱，由于固定相極性極低，比目前已知的任何流動相的極性都要低，因而是標準的反相柱；

Silica（硅膠）、NH2（硅膠鍵合氨丙基硅烷）具有較高的極性，主要用于分離帶有極性基團的化合物，所用流動相的極性通常低于這些固定相，因而是標準的正相柱。CN（硅膠鍵合腈丙基）的極性適中，當流動相極性超過CN時，它屬于反相柱，反之則是正相柱。

2. 色譜柱規格對分析結果會產生何種影響？ 

色譜柱內徑決定載樣量，載樣量與內徑的平方成正比；色譜柱長度與塔板數成正比，與柱壓成正比；粒徑影響渦流擴散相，粒徑越小渦流擴散相越小，柱效越高，粒徑與柱效近似成反比；粒徑越小，壓力也越大，壓力與粒徑的平方成反比。

填料孔徑對分析對象的分子量有限制，當孔徑為分析物尺寸的5倍以上時，分析物才能順利通過孔隙，孔徑處于60~120 ?的色譜柱適用于相對分子量小于10000的分析物，孔徑為300 ?的色譜柱可以滿足分子量處于10000以上的大分子化合物分析。

3. 液相色譜分析中如何才能提高分離度？ 

下式為分離度計算公式：

N：柱效(Efficiency)反映色譜柱性能，柱效越高，分離度越好。在其他條件恒定的情況下，塔板數增加一倍，分離度僅提高40%。操作中，可通過下面兩種方式增加塔板數進而提高分離度：其一，使用長柱或雙柱串聯，但也會使分離時間大大延長；其二，使用細粒徑填料的色譜柱，但這需要耐更高壓力的液相色譜系統。相比之下后者更為可取。

α：選擇性(selectivity)是指色譜柱-流動相體系分離兩個化合物的能力。選擇性主要與固定相、流動相組成以及柱溫等因素有關，與保留值也密切相關，其中固定相和流動相組成影響較大。

以最常見的反相模式為例，反相柱(包括C18、C8、PH等)是以分配作用對化合物進行保留的，不同化合物的分離是基于它們在鍵合相與流動相中分配系數的差異，如果兩種化合物的水溶性、在烷烴-水體系的分配系數等方面存在明顯差異，那么這些化合物通常是能夠利用反相柱達到分離；PH柱對具有苯環的化合物具有特殊保留。

正相模式下，硅膠柱、胺基柱、氰基柱與帶有極性基團的化合物之間存在極性相互作用，對化合物的基團具有選擇性，常常用于結構類似物、異構體化合物的分離。流動相方面，降低流動相的洗脫強度通常可以增大分離度；而有機溶劑類型也會影響分離，比如反相條件下，乙腈和甲醇的選擇性就存在很大差異，這種差異需要在實踐中摸索，但無論如何，多種溶劑類型帶給我們更多的實現分離的可能。

k：隨著容量因子k的增大，分離度也隨之增加，這種影響在k值較低時非常明顯，當k值大于10時，k值增加對分離度的影響就不再顯著，這就告誡無原則地提高k值以增大分離度是沒有意義的。增加鍵合相密度能夠提高k值；另外改變鍵合基團類型也能改變k值，比如在反相色譜中，隨著鍵合相碳鏈長度的增加，k值逐漸增大。

4. 何謂封端？封端的意義是什么？ 

硅膠表面的硅羥基(Si-OH)密度為8 μmol/m2，由于空間位阻的存在，硅烷化鍵合反應最多只能覆蓋50%的硅羥基，超過一半的硅羥基是活性硅羥基。這些硅羥基與化合物的極性基團存在極性相互作用和離子交換作用，為化合物的保留增加了不被期望的作用力，往往會影響峰形。用短鏈氯硅烷（如三甲基氯硅烷）鍵合活性的硅羥基，可以減小甚至消除這種影響，這種操作被稱為封端(Endcap)。

封端處理的意義：
抑制了特異性吸附，提高了色譜峰的對稱性，并改善了分離效果；
在一定程度上掩蔽了硅膠表面，使其對堿性環境的耐受性增強；
通過空間位阻掩蓋了鍵合反應形成的Si-O-Si鍵，使其對酸性環境的耐受性增強；可能會影響對極性樣品的選擇性。

5. 柱床塌陷和鍵合相塌陷 

柱床塌陷是指色譜柱使用一段時間后色譜柱入口處的柱床產生可見的空隙。該空隙的存在增大了死體積，會導致色譜柱柱效下降。造成柱床塌陷的原因如下：
其一，色譜柱填裝時的壓力過低，填裝不緊密，在高壓下使用一段時間，開始出現空隙；
其二，操作壓力超出色譜柱填料的耐壓值，導致填料顆粒破碎產生空隙；
其三，流動相溶解填料導致空隙出現。鍵合相塌陷是指由于流動相極性與鍵合相極性相差太大，鍵合相無法在流動相中充分伸展而倒伏、纏結在一起，比如普通C18在純水相條件下。相塌陷會導致色譜柱對化合物的保留不足。

6. 系統壓力升高的原因及排除 

使用者通過觀察儀器的系統監測掌握系統的壓力，如果發現壓力偏高，不要立即認為“柱壓高了”，因為系統壓力通常由柱前壓力、色譜柱壓力和流通池壓力加合而成。

此時正確的做法是：在操作條件下，測定系統壓力，得到p總；卸下色譜柱，在相同條件下，測定柱前壓力，得到p前；用兩通將泵流出管路與流通池連接，在操作條件下，測定壓力，得到p(前+后)。通過計算找出壓力高是來自柱前、色譜柱還是柱后。

以上情假設沒有安裝保護柱，如果安裝了保護柱，壓力升高時應先測試保護柱的壓力，以便確認問題是否來自保護柱。