概要

多劑量瓶(MDV)廣泛用于大多數(shù)生物制藥，在使用前會(huì)被抽取到塑料注射器中。然而，使用含有硅油的塑料注射器(SO注射器)處理治療性蛋白質(zhì)時(shí)形成的可分解顆粒可能存在問題。本研究旨在評(píng)估含有人免疫球蛋白(IgG)和脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)的MDV重新包裝注射器中微粒(>1 μm)形成和積累的程度和趨勢(shì)。采用光阻法(LO)和流動(dòng)成像(FI)對(duì)微粒進(jìn)行分析。使用SO注射器觀察到的微粒數(shù)量大于不含SO注射器，并且微粒數(shù)量隨著兩種藥物在注射器中重新包裝的次數(shù)不斷增加。然而，在不同品牌的SO注射器中觀察到很大的差異。相比之下，使用一種不同的技術(shù)從小瓶中提取藥物顯著減少了微粒的數(shù)量。此外，使用集成過濾針或在配方中加入穩(wěn)定劑如乙酰精氨酸和Tween 20也有助于減少顆粒的形成。

一、簡介

多劑量瓶(mdv)比單劑量瓶(sdv)或預(yù)充注射器具有顯著的經(jīng)濟(jì)和后勤優(yōu)勢(shì)，特別是在大規(guī)模免疫規(guī)劃中。mdv是密封的容器，允許連續(xù)提取藥物部分而不改變殘留部分的質(zhì)量，包括純度、濃度和無菌。mdv被廣泛用于Covid- 19疫苗，包括Moderna和輝瑞的疫苗。然而，已經(jīng)報(bào)道了一些使用注射器將藥物從mdv中重新包裝的不良事件，如微生物污染、形成可見顆粒和導(dǎo)致免疫反應(yīng)。一項(xiàng)研究報(bào)道了使用mdv治療聚乙二醇肽可導(dǎo)致過敏反應(yīng)和死亡。對(duì)于可見微粒，MDV批次中觀察到的微粒數(shù)量(>1 μm)高于SDV批次，這表明過敏反應(yīng)與MDV中微粒的產(chǎn)生有關(guān)。

使用硅油注射器(SO注射器)可增加微粒的生成已被廣泛研究。研究表明，由于硅油的存在，亞可見顆粒的形成增加，而彈射或掉落注射器等機(jī)械應(yīng)力進(jìn)一步增加了顆粒的形成。硅油誘導(dǎo)的微粒可使患者發(fā)生免疫原性反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)較高。Chisholm等人(2016)的研究表明，蛋白質(zhì)吸附的硅油微粒破壞了對(duì)重組蛋白的免疫耐受和抗體反應(yīng)。其他幾項(xiàng)研究報(bào)告稱，在通過胰島素注射器進(jìn)行玻璃體內(nèi)注射后，患者的玻璃體腔中存在硅油滴(或飛蚊癥)，這促使美國視網(wǎng)膜專家協(xié)會(huì)發(fā)布了關(guān)于胰島素注射器中硅油滴的警報(bào)。預(yù)充注射器或針管產(chǎn)品可以替代塑料注射器。然而，據(jù)報(bào)道，主因是在包裝從小瓶切換到預(yù)充注射器的情況下形成了蛋白質(zhì)聚集。說得更加具體的是蛋白質(zhì)暴露在某些產(chǎn)品中的硅油中，否則在小瓶中可能不會(huì)遇到。

圖1所示。圖示演示了從小瓶中提取藥物的常規(guī)逐步指導(dǎo)(稱為“來回運(yùn)動(dòng)”)

盡管有關(guān)于SO注射器不良反應(yīng)的報(bào)道，但在大多數(shù)臨床或非臨床環(huán)境中沒有采取緩解措施。此外，MDV的劑量大小為每瓶2至20劑，大多數(shù)兒童免疫接種為每瓶10或20劑，這可能會(huì)增加硅油從注射器滲入到小瓶的風(fēng)險(xiǎn)。一項(xiàng)研究報(bào)道，將貝伐珠單抗從小瓶重新包裝到SO注射器中導(dǎo)致藥物濃度下降10%，微米級(jí)蛋白顆粒(>1 μm)大幅增加，隨后患者眼壓升高。另一項(xiàng)來自復(fù)合藥房的重新包裝貝伐珠單抗樣本的研究表明，硅油是顆粒數(shù)量增加的病原體。因此，了解與使用mdv和SO注射器相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要。

考慮到這些問題，本研究旨在量化由于使用SO注射器而在MDV中形成的亞可見顆粒及其積累趨勢(shì)。我們模仿了在臨床環(huán)境中從小瓶中取出藥物的技術(shù)，這些技術(shù)也在幾個(gè)指南中提供(圖1)。以肌內(nèi)γ-球蛋白(IgG)和空脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)為模型藥物。每個(gè)小瓶中的樣品被重新包裝成8個(gè)不同品牌的注射器，而只研究了、第四、第七和第八支注射器。光阻法(LO)測定顆粒數(shù)。雖然LO通常用于計(jì)算亞可見顆粒，但它不能計(jì)算半透明顆粒，并且可能錯(cuò)誤標(biāo)記顆粒大小。因此，將流式成像(FI)技術(shù)與LO技術(shù)結(jié)合使用，以確定顆粒計(jì)數(shù)并區(qū)分顆粒的形態(tài)。通過FT-IR和評(píng)估其重量差來確認(rèn)硅油的存在。

二、材料與方法

2.1 材料和樣品制備

編號(hào):020A19001, Gamma Globulin)，由165 mg/mL人源IgG、22.5 mg/mL甘氨酸和5mg /mL氯化鈉組成，pH值為6.8，購自GC Biopharma(京畿道，韓國)。IgG用相同的緩沖液稀釋至10 mg/mL, LNP在pH 7.4的緩沖液中稀釋40倍。LNP載體(以下簡稱LNP)由脂質(zhì)膽固醇、peg2000神經(jīng)酰胺、陽離子脂質(zhì)和1,2-二硬脂酰- asn -甘油-3-磷酸膽堿(dsc)組成，由EnhancedBio Inc.(首爾，韓國)提供。注射用水(WFI)購自JW制藥公司(韓國首爾)，異丙醇(IPA)購自大田化學(xué)金屬有限公司(韓國京畿道)。n - α-乙酰- l-精氨酸和Tween™20 Surfact-Amps™洗滌劑溶液(Tween 20)分別購自Sigma-Aldrich (St. Louis, LO, USA)和Thermo Fisher Scientific (Cleveland, OH, USA)。

比較三種不同品牌的注射器:(1)kovax -注射器1 mL，可拆卸26號(hào)針頭(so -注射器1;韓國疫苗有限公司，京畿道，韓國)，(2)b1ml帶Luer-lok™尖端的注射器(so -注射器2;Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)和(3)HENKE-JECT^®兩部分一次性注射器1ml不含硅油(SO-free注射器)。所有的注射器都在有效期內(nèi)使用過。KOVAX-NEEDLE 25G (25G針頭;除了“過濾器針頭測試”外，研究中所有3支注射器都使用了韓國疫苗有限公司(Korea Vaccine Co.，京畿道，Korea京畿道)，該測試使用了胰島素/結(jié)核菌素注射器(Ezfilter^®1ml, Donghwa C&M)的可拆卸18號(hào)針頭和5 μm針頭過濾器。(首爾，韓國)。針頭從原來的注射器中分離出來使用。對(duì)于MDV，使用高壓滅菌后的5ml玻璃小瓶(BT134005, Hwankyung Tech, Seoul, Korea)，在重新包裝前用20mm橡膠塞和鋁壓蓋將其封閉。對(duì)于再包裝注射器，8支注射器從5 mL裝藥的小瓶中取出0.5 mL (n = 3)，第1、4、7、8支注射器用于顆粒分析。

圖2所示。(a)研究中使用的代表性塑料注射器和針頭，(b)使用WFI和IPA從每種類型的20支注射器中提取的干燥殘留物的重量，以及(c)從塑料注射器中提取的殘留物的疊加FT-IR光譜。

2.2 衰減全反射FT-IR光譜

使用Nicolet iS5分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)配備iD5鉆石衰減全反射附件來鑒定硅油。在室溫下測量紅外光譜。為了從注射器中提取硅油，每種型號(hào)各取50支注射器，先充入0.5 mL的IPA，倒置10次，然后將內(nèi)容物釋放到50 mL的燒杯中。IPA在100°C下干燥，直到獲得恒定重量。提取物用100 μL異丙醇重溶。將制備好的樣品取5 μL置于結(jié)晶板上干燥5min，在4000 cm??1 ~ 400 cm??1范圍內(nèi)記錄64幅干涉圖，分辨率為4 cm??1。采用Nicolet Omnic軟件8.2.387對(duì)樣品進(jìn)行光譜分析。

2.3 硅油含量

為了測定塑料注射器中硅油(即可浸出的)的相對(duì)含量，20支注射器各充入0.5 mL WFI和IPA。填充后，注射器用注射器蓋密封并倒置10次，然后將內(nèi)容物釋放到預(yù)稱重的玻璃小瓶中。將小瓶中的溶劑在100℃下完全干燥，直到獲得恒定重量，并記錄干燥提取物的重量。

2.4 光阻法

使用HIAC 9703+液體粒子計(jì)數(shù)器(Beckman-Coulter, Brea, CA, USA)獲得顆粒濃度。在每次分析之前，用0.2 μm minusart^®NML無表面活性劑醋酸纖維素注射器過濾器(Sartorius AG, Goettingen，德國)過濾的去離子水沖洗流體路徑，然后測量相同的顆粒計(jì)數(shù)以確認(rèn)檢測器的清潔度。<10個(gè)粒子(p)/mL被認(rèn)為是可接受的背景值。每個(gè)樣品測量5次，每次測量體積為0.1 mL。使用3個(gè)結(jié)果的平均值(即刪除次和最后一次檢測的結(jié)果)來計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。通過儀器自帶的PhamSpec軟件(版本為3.5.32)獲得粒徑>2 μm、>5 μm、>10 μm和>25 μm的顆粒。數(shù)據(jù)依次排列在2 ~ 10 μm、10 ~ 25 μm和>25 μm的尺寸范圍內(nèi)。

2.5 流式成像法

采用配備10倍放大鏡的Flowcam 8100 (Fluid-imaging Technologies, ME, USA)對(duì)顆粒濃度(p/mL)及其形態(tài)進(jìn)行分析。在每次樣品測量之前，測量去離子水以確認(rèn)流體路徑和流池的清潔度。顆粒濃度< 50 p/mL被認(rèn)為是可接受的背景值。在所有的測量中，使用未經(jīng)稀釋的0.5 mL樣品溶液，以避免形成的顆粒解離(數(shù)據(jù)未顯示)，0.1 mL的樣品溶液以0.1 mL/min的流速測量5次。和第五項(xiàng)分析從數(shù)據(jù)收集中刪除。基于ABD的顆粒粒徑范圍為1 ~ 10 μm、10 ~ 25 μm和>25 μm。通過3個(gè)連續(xù)測量和3個(gè)單獨(dú)的小瓶計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。使用儀器自帶的VisualSpreadsheet軟件(4.17.14版本)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

實(shí)驗(yàn)分三次進(jìn)行，使用Excel程序計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

在Microsoft Excel中使用Student’s t-test比較LO和FI的結(jié)果。每次分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性用單尾p值表示，p值分為<0.05(*)、<0.01(**)和<0.001(***)三類。所有數(shù)據(jù)均以均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示(n = 9)。

圖3所示。在WFI上通過LO(上)和FI(下)進(jìn)行顆粒分析，從小瓶中來回移動(dòng)重新包裝在塑料注射器中。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001表示重新包裝的注射器中顆粒濃度與之前的注射器相比增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(重新包裝的注射器#4 >重新包裝的注射器#1;重新包裝的注射器#7 >重新包裝的注射器#4;重新包裝注射器#8 >重新包裝注射器#7)

三、結(jié)果與討論

注射器內(nèi)硅油含量

圖2a顯示了不同類型的含硅油和不含硅油的注射器以及實(shí)驗(yàn)中使用的針頭。在之前的研究中，我們使用IPA對(duì)SO注射器中的硅油殘留物進(jìn)行提取和定量。由于大多數(shù)藥物配方都是基于水性溶劑，與IPA一起，WFI還用于相對(duì)量化塑料注射器的可浸出水平。

圖2b顯示了使用IPA和WFI從每種類型的20支注射器中提取的干燥殘留物的重量。由于溶解度的差異，ipa提取殘留物的數(shù)量可能更高。如圖所示，so -注射器1產(chǎn)生的殘留量最多(20支注射器的平均值:WFI為1.20 mg, IPA為20.66 mg)，其次是so -注射器2(20支注射器的平均值:WFI為0.68 mg, IPA為5.27 mg)，這表明不同供應(yīng)商的注射器中可浸出水平差異很大。進(jìn)一步用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)對(duì)萃取物進(jìn)行分析，以確定殘留物中存在硅油。如圖2c所示的FT-IR光譜顯示，硅油在1260 cm??1 (CH3在Si-CH3中的彎曲振動(dòng))、1090 cm??1、1020 cm??1 (Si-O-Si的不對(duì)稱拉伸振動(dòng))和800 cm??1 (Si-C在Si-CH3中的拉伸振動(dòng))處有明顯的吸收帶[31,32]。此外，F(xiàn)T-IR上的吸光度與殘留物的數(shù)量相關(guān)，如圖2c所示，進(jìn)一步證實(shí)殘留物主要是硅油。有趣的是，盡管在FT-IR光譜中沒有觀察到硅油相關(guān)的峰，但在無so注射器中也發(fā)現(xiàn)了少量殘留(WFI中平均0.07 mg, IPA中平均0.26 mg)。在這種情況下，檢測到酰胺在3184和3375 cm??1處的N-H拉伸峰(數(shù)據(jù)未顯示)和在1631和1557 cm??1處的C - - 0拉伸峰，表明無so注射器提取物中使用的油酰胺型潤滑劑存在。

so -注射器1和so -注射器2的硅油每面積重量分別為0.08 mg/cm2和0.02 mg/cm2，均在ISO 7886- 1:2017的一般限值(0.25 mg/cm2)內(nèi)。相比之下，使用可以完全溶解硅油的乙酸乙酯可以產(chǎn)生更大的量。然而，我們?cè)诒狙芯恐袥]有使用有機(jī)溶劑，因?yàn)樗矔?huì)提取雙酚A，并且會(huì)增加so -注射器2中提取物的重量。因此，即使是輕微的攪拌，如傾斜注射器幾次，也會(huì)導(dǎo)致硅油從充滿WFI的注射器釋放到MDV中。我們進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，以評(píng)估有和沒有模型藥物的SO注射器產(chǎn)生的mdv中的顆粒積累程度。

圖4所示。10 mg/mL IgG，重新包裝在塑料注射器中(a)， (b)無來回運(yùn)動(dòng)。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001表示重新包裝的注射器中顆粒濃度與之前的注射器相比增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(重新包裝的注射器#4 >重新包裝的注射器#1;重新包裝的注射器#7 >重新包裝的注射器#4;重新包裝注射器#8 >重新包裝注射器#7)

再包裝注射器中WFI的顆粒分析

硅油在注射器內(nèi)的釋放及其對(duì)生物藥品穩(wěn)定性和有效性的影響以及免疫原性風(fēng)險(xiǎn)在過去20年中已經(jīng)有報(bào)道。如圖1所示，將藥品取出的方法可能會(huì)增加污染瓶中剩余藥品的風(fēng)險(xiǎn)。這將帶來更大的mdv風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)橥ㄟ^每次注射器制備引入小瓶的任何顆粒都可能被攜帶到連續(xù)的注射器上。為了證實(shí)顆粒數(shù)量隨著注射器制備而增加的假設(shè)，最初進(jìn)行了預(yù)測試，將小瓶中的WFI重新包裝到8個(gè)帶硅油和不帶硅油的注射器中。然后使用LO和FI評(píng)估注射器的顆粒計(jì)數(shù)。

圖3顯示了用LO和FI測定的瓶子中再包裝注射器中WFI的顆粒濃度(p/mL)。結(jié)果表明，LO和FI的顆粒濃度相差大于10倍。這種差異已被廣泛報(bào)道，并歸因于LO檢測光學(xué)對(duì)比度低和/或折射率與介質(zhì)相似的顆粒的能力有限。與標(biāo)準(zhǔn)聚苯乙烯珠(折射率為1.6)不同，硅油(1.405)和水(1.333)的折射率差異很小，可能限制了LO對(duì)硅油顆粒的檢測。然而，LO和FI識(shí)別的顆粒尺寸在1- 25 μm范圍內(nèi)，在1-或2-10 μm范圍內(nèi)顆粒負(fù)荷較高。這一觀察結(jié)果與之前的一項(xiàng)研究一致，該研究報(bào)告在2-8?C下儲(chǔ)存90天后，注射器中1-10 μm范圍內(nèi)產(chǎn)生了更多的硅油顆粒。相應(yīng)的，LO檢測到的>25 μm的顆粒數(shù)量可以忽略不計(jì)，而FI沒有檢測到這樣的顆粒。

圖3顯示了基于注射器類型的結(jié)果評(píng)價(jià)，可見so -注射器1的顆粒計(jì)數(shù)最高，其次是so -注射器2，與各自注射器中的硅油含量相當(dāng)(圖2b)。在無so注射器中也檢測到顆粒，盡管相對(duì)較少。圖2c所示的FT-IR數(shù)據(jù)得到了先前研究的證實(shí)，表明殘留物可能是從無so注射器的內(nèi)表面釋放出來的油酰胺。此外，從LO和FI獲得的數(shù)據(jù)顯示，無論注射器類型如何，隨著重新包裝計(jì)數(shù)的增加，顆粒積累的模式相似。在所有類型的注射器中，顆粒濃度隨每次重新包裝而增加，這支持了我們的假設(shè)。最初，在1 - 10 μm范圍內(nèi)，重新包裝的so -注射器1、so -注射器2和無so -注射器1中的顆粒濃度(即按FI計(jì)算)分別為1246 p/mL、1038 p/mL和874 p/mL，在重新包裝的注射器8中分別增加到9830 p/mL、5744 p/mL和3458 p/mL。結(jié)果表明，高變異性的管理注射器和一個(gè)令人驚訝的結(jié)果，顆粒濃度的增加取決于重新包裝注射器的數(shù)量。

此外，每次重新包裝時(shí)顆粒濃度的增加也提出了在臨床環(huán)境中通常使用的提取技術(shù)(來回移動(dòng))的問題(圖1)。從小瓶中提取藥品時(shí)經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生氣泡。在步驟4中，輕彈注射器使氣泡向注射器尖端移動(dòng)會(huì)引起機(jī)械應(yīng)力，從而導(dǎo)致硅油或其他潤滑劑從內(nèi)桶中遷移[16]。此外，推動(dòng)柱塞將氣泡釋放到瓶中，將釋放的潤滑劑引入瓶中。Melo等人的研究報(bào)道，輕彈注射器引起的SO液滴水平升高可能導(dǎo)致眼內(nèi)注射患者不良反應(yīng)增加。圖3所示的結(jié)果表明，在含潤滑劑注射器中使用前后運(yùn)動(dòng)和輕彈會(huì)導(dǎo)致每次重新包裝時(shí)MDV中的顆粒(可浸出)濃度增加，這可能與藥物相互作用，影響藥物的療效和穩(wěn)定性。

圖5所示。用FI對(duì)10 mg/mL IgG進(jìn)行顆粒分析，重新包裝在塑料注射器中(a)， (b)沒有來回運(yùn)動(dòng)。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001表示重新包裝的注射器中顆粒濃度與之前的注射器相比增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(重新包裝的注射器#4 >重新包裝的注射器#1;重新包裝的注射器#7 >重新包裝的注射器#4;重新包裝注射器#8 >重新包裝注射器#7)

再包裝注射器中藥物顆粒分析:前后運(yùn)動(dòng)的影響

我們以10 mg/mL IgG為模型藥物，考察硅油和來回法對(duì)蛋白治療的影響。圖4和圖5分別顯示了使用LO和FI分析的再包裝注射器的顆粒分析。當(dāng)在小瓶中存在IgG的情況下進(jìn)行前后移動(dòng)時(shí)，與WFI相比，在所有尺寸范圍內(nèi)都觀察到顆粒濃度的顯著增加。在2個(gè)品牌的SO注射器中，每次重新包裝都有明顯的增加趨勢(shì)，表明所產(chǎn)生的微粒的積累和轉(zhuǎn)移。與WFI樣品(圖3)相比，重新包裝的注射器#8中，so -注射器1、so -注射器2和無so -注射器的顆粒計(jì)數(shù)分別比LO觀察的增加了5倍、6倍和3倍(圖4a)，比FI觀察的增加了11倍、4倍和3倍(圖5a)。結(jié)果表明，與不使用SO的注射器相比，使用SO的注射器顆粒濃度增加的傾向更高，表明硅油是顆粒形成的原因。此外，還觀察了不同品牌SO注射器顆粒濃度的差異。造成差異的原因可以解釋為從注射器中釋放的硅油量不同(圖2b)，可能在使用so -注射器1時(shí)提供了更多的形成蛋白膜和顆粒的位點(diǎn)(圖3、4a和5a)。然而，無論不同品牌，兩種SO注射器均存在>25 μm的顆粒，而在WFI中，這一差異不顯著。顆粒的代表性FI圖像顯示，在IgG存在的情況下，硅油與吸附的蛋白質(zhì)形成了一個(gè)復(fù)合物，形成了尺寸>25 μm的更大的亞可見顆粒(圖6)。此外，藥物介質(zhì)對(duì)過程中微粒的形成也有顯著影響。甘氨酸在本研究中作為IgG的賦形劑，通過減少界面吸附的有效性來增加蛋白質(zhì)分子展開的能量，這可能是在SO存在下形成微粒的主要途徑，使蛋白質(zhì)分子容易被吸附到SO表面。先前的研究表明，在注射筒處的硅油表面可以形成蛋白質(zhì)層。初級(jí)層是不可逆結(jié)合，而隨后的層是可逆結(jié)合，并且容易被柱塞頭的掃力解吸，釋放微粒。此外，幾項(xiàng)攪拌研究表明，硅油顆粒從注射器筒中釋放出來，為其表面形成蛋白質(zhì)膜提供了一個(gè)表面，并增加了顆粒濃度。將注射器鍍硅主要是為了減小柱塞與筒體內(nèi)表面之間的滑動(dòng)力。由于硅油已被證明會(huì)增加注射器中的微粒濃度，具有等效斷裂損失和滑動(dòng)力的非硅化材料可能是緩解此類問題的替代品。

雖然用不含SO的注射器代替SO注射器減少了顆粒負(fù)荷，但顆粒仍在生成，并且顆粒濃度隨著重新包裝的增加而增加的趨勢(shì)持續(xù)存在，這意味著它們與高蛋白濃度的產(chǎn)品不相容。進(jìn)行了進(jìn)一步的調(diào)查，以確定不同的提取技術(shù)是否可以防止不可見顆粒的積累和攜帶到連續(xù)的注射器中。在步驟4(圖1)中輕彈注射器使氣泡移動(dòng)到噴嘴頂部后，注射器從小瓶中取出。然后，當(dāng)推動(dòng)柱塞時(shí)，氣泡被釋放到空氣中，直到藥物溶液暴露在針頭的末端。然后將注射器插入小瓶中以調(diào)整所需的藥物溶液體積。因此，在重新包裝的注射器#8中，觀察到顆粒計(jì)數(shù)顯著減少，分別由LO和FI檢測到約2至4倍減少(圖4b)和4至20倍減少(圖5b)。此外，當(dāng)改變前后運(yùn)動(dòng)(圖4b)時(shí)，重新包裝的注射器#8與無so注射器(圖4a)之間的顆粒濃度差異(幾乎是10倍)最小(圖4a)。這一結(jié)果突出了指南中提供的提取技術(shù)和防止硅油顆粒積聚方法的缺點(diǎn)。

圖6所示。在10 mg/mL IgG中觀察到的顆粒的代表性FI圖像，重新包裝在含有SO的塑料注射器中(右)，沒有來回運(yùn)動(dòng)(左)

此前已有研究報(bào)道硅油對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響。然而，其在用于核酸藥物遞送的LNP制劑中的作用尚未研究。考慮到最近LNP配方的流行以及MDVs用于Covid-19疫苗，研究藥物穩(wěn)定性的各個(gè)方面對(duì)于確保患者安全給藥至關(guān)重要。在LNP上使用相同的程序重復(fù)測試。然而，由于FI結(jié)果似乎比LO更敏感，因此僅包括FI數(shù)據(jù)以供進(jìn)一步討論。圖7a和b顯示了使用FI分析的重新包裝LNP的顆粒濃度。在連續(xù)重新包裝的注射器中，顆粒濃度隨前后運(yùn)動(dòng)呈增加趨勢(shì)(圖7a)。當(dāng)避免前后運(yùn)動(dòng)(圖7b)時(shí)，顆粒計(jì)數(shù)沒有明顯增加，不同類型注射器之間的差異較小。

與硅油誘導(dǎo)的IgG顆粒積聚不同，在LNPs的代表性FI圖像中區(qū)分硅油顆粒是具有挑戰(zhàn)性的(圖8)。通常，硅油顆粒是根據(jù)其圓形和中空度與其他顆粒進(jìn)行光學(xué)區(qū)分的;硅油誘導(dǎo)顆粒的核心更亮，核心和邊緣之間的對(duì)比度也很高。然而，LNP樣品中的此類顆粒很少(圖8)。這可以推測，因?yàn)長NP與SO相互作用或團(tuán)聚產(chǎn)生了比蛋白質(zhì)顆粒更致密、折射率更高的顆粒。我們沒有進(jìn)行進(jìn)一步的表征，因?yàn)槟壳暗难芯恐荚谧C明在給藥前，重新包裝的標(biāo)簽外使用SO注射器與多用途小瓶中的藥物質(zhì)量不同。同樣，在重新包裝過程中盡量減少來回運(yùn)動(dòng)可以減少小瓶中的顆粒積聚并攜帶到注射器中。

圖9所示。用FI對(duì)(a) 10mg /mL IgG進(jìn)行顆粒分析，用過濾器集成針重新包裝在塑料注射器中(注射器中未使用過濾針的數(shù)據(jù)見圖3)，(b) 10mg /mL IgG加入添加劑后重新包裝在塑料注射器中，(c) LNP加入添加劑后重新包裝在塑料注射器中。所有樣品都被重新包裝，前后移動(dòng)。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001表示帶濾芯針與不帶添加劑樣品的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

過濾器集成針在重新包裝中的影響

美國衛(wèi)生系統(tǒng)協(xié)會(huì)建議在使用單劑量安瓿時(shí)使用5 μm過濾器集成針頭，以降低將玻璃顆粒注射到患者體內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)。一些研究表明，集成過濾器的針頭可以有效地減少玻璃顆粒污染。在線過濾器也被用于靜脈輸液，以防止微顆粒成分進(jìn)入血液循環(huán)[59]。在之前的一項(xiàng)研究中，與不使用過濾器的針頭與SO注射器一起使用相比，使用過濾器集成針頭可以降低IgG制劑中的顆粒濃度。在此基礎(chǔ)上，評(píng)價(jià)了5 μm過濾集成針對(duì)含IgG的mdv再包裝的效果。使用過濾器集成針降低了所有粒徑范圍內(nèi)的顆粒濃度(圖9a)。使用FI測定，重新包裝的注射器#8中粒徑為1 - 10 μm的顆粒數(shù)量在so -注射器1中從111,414 p/mL減少到95,614 p/mL，在so -注射器2中從23,238 p/mL減少到15,524 p/mL。在粒徑> 10 μm范圍內(nèi)，使用該過濾器可降低顆粒濃度。但粒徑>5 μm的顆粒仍存在，且其數(shù)量高于消除前后運(yùn)動(dòng)后的顆粒。這可能是由于硅油和/或誘導(dǎo)顆粒的靈活性，可以通過過濾膜;此外，在分析之前沒有更換過濾器。然而，數(shù)據(jù)表明，過濾器集成針頭可以通過減少小瓶中的積聚來降低攜帶到連續(xù)注射器中的微粒水平，特別是在so注射器2中。

吐溫20和乙酰精氨酸對(duì)再包裝的影響

已知非離子表面活性劑，如聚山梨酯，可以降低單克隆抗體的界面應(yīng)力，從而最大限度地減少硅油存在下的顆粒形成。表面活性劑濃度大于其臨界膠束濃度(CMC)已被證明在將蛋白質(zhì)分子從界面上取代方面特別有效[62]。然而，SO的存在進(jìn)一步增加了蛋白質(zhì)吸附的界面面積，因此需要使用更多的表面活性劑來減少界面吸附。此外，150 mM的n - α-乙酰- l-精氨酸(acetyl- l-arginine，乙酰精氨酸)被報(bào)道在硅油存在下抑制攪拌應(yīng)力中IgG的亞可見顆粒形成。因此，在本研究中，在IgG和LNP中加入10× 20和150 mM乙酰精氨酸cmc，比較它們?cè)谥匦掳b到SO注射器時(shí)減少顆粒形成的效果。當(dāng)添加到IgG中時(shí)，Tween 20和乙酰精氨酸在所有尺寸范圍內(nèi)的顆粒濃度都有所降低(圖4a和5a與圖9b相比)。在SO注射器1中，與重新包裝的注射器7相比，顆粒濃度的降低是顯著的，這表明在注射器制備過程中，浸出硅油表面的蛋白質(zhì)膜形成受到抑制。

相比之下，LO和FI結(jié)果表明，添加Tween 20后，1-10 μm的IgG顆粒數(shù)量相對(duì)較多。大多數(shù)與硅油相關(guān)的顆粒(在WFI中)的大小在1-10 μm之間(圖2)。考慮到Tween 20由于其高濃度會(huì)影響IgG的高階結(jié)構(gòu)，它可能導(dǎo)致IgG的Fab區(qū)發(fā)生化學(xué)位移，而乙酰精氨酸對(duì)其構(gòu)象的影響最小，只是阻止疏水相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用減少。然而，與乙酰精氨酸相比，Tween 20在> 10 μm的尺寸范圍內(nèi)產(chǎn)生了更好的顆粒還原效果，這表明Tween 20對(duì)空氣-水或其他界面應(yīng)力的主要影響，減少了更大顆粒的形成。總體而言，與使用過濾器集成針頭相比，使用添加劑對(duì)重新包裝注射器中硅油誘導(dǎo)顆粒的減少效果更好(圖9a與圖9b)。同樣，在重新包裝LNP時(shí)，Tween 20和乙酰精氨酸也能有效地減少所有尺寸范圍內(nèi)的顆粒(圖9c)。因此，在將藥物投放市場之前，還應(yīng)考慮最大限度地減少超說明書使用注射器中的顆粒形成，并需要優(yōu)化制備指南，以確保給藥前的藥物質(zhì)量。

本研究旨在評(píng)估so注射器重復(fù)使用MDV時(shí)顆粒蓄積量。WFI、人源IgG和LNP三種溶液的顆粒水平均升高，尤其高于無so的注射器。其濃度和大小可能因生物藥品及其制劑的物理特性而異。考慮到wfi填充的MDV中顆粒濃度呈持續(xù)增加的趨勢(shì)(圖3)，硅油或微粒的積累會(huì)對(duì)下一次重新包裝的注射器產(chǎn)生影響。另一方面，本研究的局限性在于只使用了LNP載體。因此，由于LNP與塑料注射器中硅油的相互作用可能與COVID-19疫苗等商業(yè)產(chǎn)品不同，因此沒有進(jìn)一步表征LNP與硅油的相互作用。然而，硅油在MDV中積累的影響絕不能被低估，例如，在使用低死區(qū)注射器(LDS)時(shí)，通過清除小瓶中的殘留物來提供額外的劑量。

結(jié)論

本研究表明，每次連續(xù)注射器從多用途小瓶中提取硅油誘導(dǎo)的亞可見顆粒增加。改變停藥技術(shù)減少了微顆粒的數(shù)量，提示有必要修改制備指南。此外，使用過濾器集成針或穩(wěn)定劑也減少了顆粒的形成。顆粒濃度可能與市場上的“真正”藥品不同。然而，考慮到在生物制藥中越來越多地使用耐多藥，認(rèn)識(shí)到與亞可見顆粒的產(chǎn)生及其在小瓶中的積累有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)以及所使用的材料類型和技術(shù)的影響至關(guān)重要。