最近，總有小伙伴們前來詢問在做完電轉實驗后，發現轉染效率太低了該怎么辦，于是小優通過搜集多方資料、詢問技術專家，為大家找來了一些解決方案，下面我們就來一起看看吧～

一、什么是電轉？

俗話說得好，知己知彼，方能百戰百勝，所以首先我們需要清楚電轉的原理。電轉，也稱電穿孔法，是通過脈沖電流在細胞膜上打孔，將外源分子（DNA、RNA 、mRNA等）導入真核細胞內，來改變細胞的特性，從而達到改造細胞的目的，是實現細胞基因功能和蛋白質表達研究的重要工具。與其他細胞轉染技術相比，電轉具有操作簡便、適用多種細胞、重復性好和轉染效率高等優點。

二、影響電轉效率的因素有哪些呢？

影響電轉效率的因素有很多，總結下來有三方面：電轉過程、細胞狀態以及轉染底物狀態。只有了解影響電轉效率的因素有哪些，我們才能夠“對癥下藥”。

1.電轉過程

1）電轉的完整操作步驟包括電轉前操作，電轉執行和電轉后培養。在進行電轉前操作時，電轉試劑、細胞與轉染底物要進行混勻，如果混勻時過于激烈，會破壞轉染復合物的形成，從而導致轉染效率降低；

2）在進行電轉前操作時，電擊緩沖液的選擇也很重要，由于細胞對緩沖液的離子組成和滲透壓非常敏感，因此組分與細胞質類似的緩沖液有利于細胞電擊后的存活；

3）電轉執行時，需要控制電場強度和脈沖時間。適當提高電場強度或延長脈沖時間，能使底物更容易進入細胞，但細胞的死亡率也會增加。一般電場強度設置遵循低電場長時程的原則。如果選擇內置優化程序的電轉系統，如Lonza的Nucleofector系統，則可以節省摸索電場強度和脈沖時間的步驟。

4）轉染培養基中含有抗生素會影響細胞轉染效率，這是因為轉染試劑對細胞有損傷，這時培養基中的抗生素會進一步損傷細胞，因此我們建議使用不含抗生素的培養基或PBS；

5）電轉后培養要注意，如果使用傳統轉染試劑，轉染后4-6h后必須進行換液，否則會由于轉染試劑毒性而引起細胞死亡，最終影響轉染效率。

2.細胞狀態

1）細胞污染對細胞狀態的影響很大，受到細菌、真菌或支原體污染的細胞都會導致轉染效率降低、細胞死亡率增加，尤其是支原體污染悄無聲息，因此一定要做好定期的支原體檢測，確保細胞狀態；

2）細胞培養到不同密度都能用于電轉，但好的轉化效率是在細胞的對數生長期（15代以內，傳代后2d）。當細胞處于對數生長期時，有絲分裂較旺盛，表面結構密度比穩定期的細胞差，電轉后，細胞膜的恢復能力強，而且處于有絲分裂期的細胞更容易接受外源DNA。

3.轉染底物狀態

1）不同的轉染底物對轉染效率都會產生不同的影響，例如質粒DNA在大小、用量以及構象這三方面都影響著電轉效率，IRES導致轉染效率低，轉染mRNA需要調整洗滌次數等等；

2）轉染試劑與底物的配比，也會影響轉染效率，因此需要根據說明書或參考文獻來進行配比優化實驗，選用最佳配比濃度；

3）底物的內毒素，也會影響轉染效率，內毒素含量過高，會導致轉染過程中細胞狀態變差，從而增加細胞死亡率，降低轉染效率，因此要對內毒素進行控制。

三、如何提高電轉效率？

我們都知道，電轉的操作是需要借助儀器來完成的，因此除了要考慮上面的這些因素外，更重要的是選擇一個高效的電轉儀。Nucleofector™技術是Lonza公司的zhuan利創新技術，利用電擊在細胞膜上開個小孔，綜合各種特定細胞轉染程序與轉染液的作用，核酸底物不僅可以進入細胞質，還可直接通過核膜進入細胞核。相較于傳統電轉技術，Nucleofector™技術的細胞轉染率可達99%，且實現轉染不依賴于細胞的分裂。

01 Nucleofector™技術核心：核電轉

利用特定的轉染試劑和細胞保護劑，通過細微差別的電脈沖，使得轉染物質不僅可以直接進入細胞質，而且可以直接通過核膜進入到細胞核。

注：圖片來自Lonza

02 Nucleofector™技術組成

1）Nucleofector™設備：內置針對每種細胞優化好的轉染參數。

2）配套試劑盒：試劑盒是包含有轉染試劑，細胞保護劑，專用電極杯，吸管、pmaxGFP™陽性質粒。

3）數據庫與操作手冊：幾百種細胞的詳細的優化方案，不僅有轉染步驟，也包含了核轉染前后細胞的處理，如細胞來源、傳代、生長條件、培養基以及轉染后培養等細節技巧。

03 提高電轉效率的方法

1.細胞收集時：

1)在消化貼壁細胞時，一定要注意終止胰酶反應，防止過度消化；最好使用專業的胰酶中和劑；

2)在進行細胞離心時，使用低轉速長時間離心，提升細胞的存活率；

3)選擇合適狀態的細胞，一般原代細胞可以傳1-2次后使用；盡量挑選迭代次數少的細胞，如果是凍存細胞，建議復蘇1-2h后使用；

4)選擇對數增長期的細胞；

5)做好支原體清除。

2.試劑添加：

1）電轉試劑的添加只需室溫操作即可；

2）細胞在試劑中停留不超20min，混合好盡快開始實驗；

3）轉染的底物占比不能大于總體積的10%，比如轉染體系100ul，底物最多添加10ul；

4）在消化的細胞進行配置時，一定要離心并wan全去除殘留培養基；

5）在加入到電極杯中時，要避免產生氣泡，從而影響電脈沖；

6）對底物進行內毒素控制；

7）轉染試劑與底物濃度配比控制；

8）如果是mRNA轉染，可多洗滌2次。

3.程序設置：

1）使用Lonza電轉儀，程序已經設定好，可以根據不同的細胞名稱，選擇對應的優程序； 根據實際情況，可以對程序進行微調，確保轉染效率和細胞存活率。

2）使用需要自行設置的儀器，一般電場強度設置遵循低電場、長時程的原則。

4.細胞重懸：

1）轉染結束之后，可以先停留10min再加培養基重懸；

2）使用無鈣培養基重懸，5-10min后轉移細胞到培養皿上；

3）后續的實驗一般在轉染后24h再進行；

4）電轉后的細胞，鋪板數量翻一倍。

5.轉染后細胞的培養：選擇表達高峰期細胞做實驗，推薦文獻可在Lonza查詢。