質(zhì)量可控是活性化合物成藥及進(jìn)行藥品安全有效性評價的前提。對藥品的質(zhì)量進(jìn)行控制應(yīng)該是多方面的，其中包括生產(chǎn)環(huán)境的控制、原輔料來源和質(zhì)量的控制、生產(chǎn)工藝過程的控制，以及按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行成品檢驗控制等。

但是，在藥品研發(fā)過程中，揭示藥品的品質(zhì)、控制藥品的質(zhì)量，通常是要針對研制藥品的特性(主藥的理化性質(zhì)及制劑的質(zhì)量要求等)確定相應(yīng)的研究測試項目，再根據(jù)測試項目的需要，建立適宜的分析方法(包括方法的選擇和方法的驗證)，最后是根據(jù)藥品質(zhì)量的要求及安全性研究結(jié)果確定各測試項目的限度，起草制訂檢驗藥品質(zhì)量的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

分析方法是揭示藥品品質(zhì)的工具和手段，方法驗證是判斷采用的分析方法是否科學(xué)、可行的過程。實際上，方法驗證就是根據(jù)確定的檢測項目的要求，預(yù)先設(shè)置一定的驗證內(nèi)容，并通過設(shè)計合理的試驗來驗證所采用的分析方法能否符合檢測項目的要求。

下面就根據(jù)《化學(xué)藥物質(zhì)量控制分析方法驗證技術(shù)指導(dǎo)原則》解讀分析方法驗證的內(nèi)容和評價要點，在對目前申報資料中分析方法驗證工作中存在的問題進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，以高效液相色譜法為例，闡述方法驗證的思路及驗證要點，希望能對藥物研發(fā)者有所幫助。

首先應(yīng)該明確的是：方法驗證的內(nèi)容應(yīng)根據(jù)檢測項目的要求，同時結(jié)合所采用的分析方法的特點確定。相同的分析方法用于不同的檢測項目時，其驗證要求是不同的。例如，采用高效液相色譜法用于制劑的鑒別和雜質(zhì)定量檢查時的驗證要求是不同的；

前者重點要驗證方法的專屬性，而后者重點要驗證方法的專屬性、準(zhǔn)確度和定量限。通常需要驗證的檢測項目：鑒別、雜質(zhì)檢查(限度試驗、定量試驗)、定量測定(含量測定、溶出度、釋放度等)，還有其他特定的檢測項目(粒徑分布、分子量分布)等。方法驗證的內(nèi)容包括專屬性、線性、范圍、準(zhǔn)確度、精密度、檢測限、定量限、耐用性(粗放度)和系統(tǒng)適用性等。

1.2線性

線性系指在設(shè)計的測定范圍內(nèi)，檢測結(jié)果與供試品中被測物的濃度(量)直接呈線性關(guān)系的程度，是定量測定的基礎(chǔ)，涉及定量測定的項目，如雜質(zhì)定量試驗和含量測定均需要驗證方法的線性。

1.3范圍

范圍系指能夠達(dá)到一定的準(zhǔn)確度、精密度和線性，測試方法適用的試樣中被測物高低限濃度或量的區(qū)間。通常用與分析方法的測試結(jié)果相同的單位(如百分濃度)表達(dá)。涉及到定量測定的檢測項目均需要驗證范圍，如含量測定、含量均勻度、溶出度或釋放度、雜質(zhì)定量試驗等。范圍應(yīng)根據(jù)劑型和(或)檢測項目的要求確定。含量測定范圍應(yīng)為測試濃度的80%～100%或更寬。制劑的含量均勻度范圍應(yīng)為測試濃度的70%～130%。

1.4準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度系指用該方法測定的結(jié)果與真實值或認(rèn)可的參考值之間接近的程度。具有一定的準(zhǔn)確度是進(jìn)行定量測定的必要條件，因此，涉及到定量測定的檢測項目均需要驗證方法的準(zhǔn)確度，如含量測定、雜質(zhì)定量試驗等。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)建立。

1.5精密度

精密度系指在規(guī)定的測試條件下，同一均質(zhì)供試品經(jīng)多次取樣進(jìn)行一系列檢測所得結(jié)果之間的接近程度(離散程度)。一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。精密度可以

從3個層次考察：重復(fù)性(同樣的操作條件下，在較短時間間隔內(nèi)，同一分析人員測定結(jié)果的精密度)、中間精密度(同一實驗室，不同時間、不同分析人員、不同儀器設(shè)備測定結(jié)果的精密度)、重現(xiàn)性(不同實驗室、不同分析人員測定結(jié)果的精密度，當(dāng)分析方法被法定標(biāo)準(zhǔn)采用時，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗)。

檢測限系指試樣中的被測物能夠被檢測到的zui低量，但不一定要準(zhǔn)確定量。該驗證指標(biāo)的意義在于考察方法是否具備靈敏的檢測能力。因此，對雜質(zhì)限度試驗，需驗證并證明方法具有足夠低的檢測限，以保證檢出需控制的雜質(zhì)。

定量限系指試樣中的被測物能夠被定量測定的zui低量，其測定結(jié)果應(yīng)具有一定的準(zhǔn)確度和精密度。它體現(xiàn)了分析方法是否具備靈敏的定量檢測能力。雜質(zhì)定量試驗，需驗證方法的定量限，以保證含量很少的雜質(zhì)能夠被準(zhǔn)確測定。

1.8耐用性

(粗放度)耐用性系指測定條件發(fā)生小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度。主要考察方法本身對于可變試驗因素的抗干擾能力。典型的變動因素包括：液相色譜法中流動相的組成、流速和pH值、不同廠牌或不同批號的同類型色譜柱、柱溫等。

對一些儀器分析方法，在進(jìn)行方法驗證時，有必要將分析設(shè)備、電子儀器與實驗操作、測試樣品等一起當(dāng)作完整的系統(tǒng)進(jìn)行評估。系統(tǒng)適用性便是對整個系統(tǒng)進(jìn)行評估的指標(biāo)，其試驗參數(shù)的設(shè)置需根據(jù)被驗證方法類型而定。色譜方法對分析設(shè)備、電子儀器的依賴程度較高，因此，所有的色譜方法均應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)適用性驗證，并將該指標(biāo)作為分析方法的組成部分。

2.1方法驗證的評價要點

方法驗證的評價應(yīng)圍繞驗證目的進(jìn)行，同時關(guān)注方法驗證內(nèi)容的全面性和試驗方案的系統(tǒng)性和合理性，以及驗證過程的規(guī)范性。

2.2方法驗證需要關(guān)注的問題

2.2.1雜質(zhì)定量方法驗證

雜質(zhì)定量試驗要驗證方法的專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍、準(zhǔn)確度、精密度等。為考察方法能否有效檢出原料藥或制劑中的雜質(zhì)，可采用原料藥尚未精制的粗品、或加入合成中間體的方法;還可根據(jù)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點、制劑的處方與工藝、貯藏條件等選用合適的酸、堿、光、熱、氧化等強(qiáng)制破壞性試驗來驗證方法的專屬性；

注意進(jìn)行破壞試驗的條件要適度，著重考察敏感條件，即不能無降解產(chǎn)物產(chǎn)生，也不能將主藥成分破壞殆盡，應(yīng)以主藥成分破壞20%～30%為宜；否則，無降解產(chǎn)物產(chǎn)生或主藥成分破壞殆盡時進(jìn)行的專屬性試驗是不能反映擬定的方法能有效將主藥與雜質(zhì)分開并能有效檢出可能的雜質(zhì)的。

另外，在進(jìn)行方法專屬性試驗時，還可采用二極管陣列檢測器、質(zhì)譜檢測器等檢測峰純度；因在強(qiáng)制降解試驗條件下產(chǎn)生的降解產(chǎn)物較藥品貨架期產(chǎn)生的降解產(chǎn)物復(fù)雜、未知雜質(zhì)多，分離難度大，二極管陣列檢測器和質(zhì)譜檢測器可有效顯示各色譜峰的純度，以免因分離度不符合要求，導(dǎo)致分析結(jié)果不準(zhǔn)確。

如果不具備檢測峰純度的試驗條件，也可通過調(diào)整流動相的組成或比例的方法使各色譜峰的相對保留時間發(fā)生改變，來印證雜質(zhì)檢查方法的專屬性。對雜質(zhì)定量方法驗證進(jìn)行評價，需要關(guān)注的問題還有雜質(zhì)的定量方法。通常，雜質(zhì)的定量方法有①外標(biāo)法(雜質(zhì)對照品法)。②加校正因子的主成分自身對照法。③不加校正因子的主成分自身對照法。④峰面積歸一化法。

雜質(zhì)對照品法定量比較準(zhǔn)確，是進(jìn)行雜質(zhì)有效控制的最直接的方法，建議已知雜質(zhì)控制盡量采用雜質(zhì)對照品法定量;此時，還應(yīng)對對照品進(jìn)行評估和確認(rèn)，制訂質(zhì)量控制要求。

加校正因子的主成分自身對照法應(yīng)對校正因子進(jìn)行嚴(yán)格測定，該方法適用于相對響應(yīng)因子在0.5～1.5范圍內(nèi)的已知雜質(zhì)的控制;超出0.5～1.5范圍時，宜采用雜質(zhì)對照品法或調(diào)整檢測波長使雜質(zhì)的相對響應(yīng)因子落在0.5～1.5范圍內(nèi)。

不加校正因子的主成分自身對照法的前提是假定雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子基本相同;相對響應(yīng)因子在0.9～1.1范圍內(nèi)，可以采用主成分自身對照法，超出0.9～1.1范圍時，宜采用雜質(zhì)對照品法或加校正因子的主成分自身對照法。峰面積歸一化法簡便快捷，但是，因各雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子有差異、雜質(zhì)量與主成分量不一定在同一線性范圍內(nèi)、儀器對微量雜質(zhì)和常量主成分的積分精度及準(zhǔn)確度不相同等因素影響定量的準(zhǔn)確性，一般不建議采用。

 2.2.2復(fù)方制劑雜質(zhì)研究的考慮要點

復(fù)方制劑雜質(zhì)的來源及種類較單方制劑復(fù)雜，其雜質(zhì)的分離檢出、定性及定量研究工作是該類制劑質(zhì)量控制研究的重點和難點，也是在評價過程中出現(xiàn)問題較多、經(jīng)常需要以補(bǔ)充資料的形式完善的研究內(nèi)容。

復(fù)方制劑雜質(zhì)的檢查方法應(yīng)兼顧不同來源的雜質(zhì)(原料藥制備過程引入的雜質(zhì)、制劑過程和/或貯藏期間的降解產(chǎn)物)，重點監(jiān)控穩(wěn)定性較差藥物的降解產(chǎn)物及有毒或有害雜質(zhì)。進(jìn)行復(fù)方制劑的雜質(zhì)研究，首先要分析各雜質(zhì)的來源，采用適當(dāng)?shù)姆椒▽﹄s質(zhì)進(jìn)行定性研究和歸屬。

由于主藥及其雜質(zhì)的理化性質(zhì)的差異可能較大，色譜行為的差異也較大，故一般要采用梯度洗脫或多種色譜條件。在采用紫外檢測器時，應(yīng)選用對各雜質(zhì)均有較強(qiáng)吸收的波長作為檢測波長;當(dāng)一個測定波長無法兼顧所有雜質(zhì)時，可選用不同波長分別進(jìn)行測定。采用不同的色譜條件分別考察各主藥的雜質(zhì)時，專屬性研究既要考察溶劑、輔料是否對被測主藥的雜質(zhì)檢測有影響，也要考察其他主藥及其雜質(zhì)是否對該條件下被測主藥的雜質(zhì)檢測有影響。

在同一色譜條件下同時考察各主藥的雜質(zhì)時，專屬性研究應(yīng)考察溶劑、輔料是否對各雜質(zhì)檢測有影響，各主藥峰及各雜質(zhì)峰是否能有效分離，各雜質(zhì)是否能明確歸屬。復(fù)方制劑中的毒性雜質(zhì)及已知雜質(zhì)，應(yīng)采用雜質(zhì)對照品法進(jìn)行定量測定。若采用加校正因子的主成分自身對照法，應(yīng)注意不同時間、不同儀器、不同實驗室間相對保留時間的波動，以及當(dāng)供試品中存在多個雜質(zhì)而分離度又較差時可能造成的雜質(zhì)定位的困難。

2.2.3方法再驗證

在某些情況下，如原料藥的合成工藝改變、制劑的處方改變、分析方法發(fā)生改變等，均需要對分析方法再次進(jìn)行全面的或部分的驗證，以確保分析方法可行，適用于變更后產(chǎn)品的質(zhì)量控制，這一過程稱為方法再驗證。進(jìn)行變更研究和仿制藥研制時需特別注意要進(jìn)行方法再驗證工作。

當(dāng)原料藥的合成工藝發(fā)生改變時，可能引入新的雜質(zhì)，雜質(zhì)檢查方法和含量測定方法的專屬性就需要重新進(jìn)行驗證，以證明雜質(zhì)檢查方法能夠檢測新引入的雜質(zhì)，且新引入的雜質(zhì)對主成份的含量測定無干擾。

當(dāng)制劑的處方發(fā)生變更時，可能會影響鑒別方法的專屬性、溶出度和含量測定的準(zhǔn)確度，此時，需要對鑒別、含量測定方法進(jìn)行再驗證。當(dāng)原料藥來源發(fā)生變更時，可能會影響雜質(zhì)檢查和含量測定的專屬性和準(zhǔn)確度，因此，需要對雜質(zhì)檢查方法和含量測定方法進(jìn)行再驗證。

當(dāng)某一項目的分析方法發(fā)生改變時，如采用高效液相色譜法測定含量的檢測波長發(fā)生改變，則要重新進(jìn)行檢測限、專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性等內(nèi)容的驗證，同時還應(yīng)進(jìn)行方法改變前后所得結(jié)果的對比研究，證明變更后的方法合理、可行。在進(jìn)行仿制藥研究時，其所用原料藥的合成工藝、制劑處方中的輔料等可能與已上市藥品不同，此時，不僅要對質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中部分項目進(jìn)行方法再驗證，還應(yīng)對根據(jù)研制品種質(zhì)量控制需要增加的測試項目所用的方法進(jìn)行驗證。

方法驗證是藥品質(zhì)量控制研究重要的組成部分，通常要貫穿藥品研發(fā)的始終。方法驗證應(yīng)圍繞驗證目的，根據(jù)測試項目的要求，結(jié)合所用分析方法的特點確定相應(yīng)的驗證內(nèi)容;同時要注意驗證試驗的過程應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)、規(guī)范。另外，隨著藥品研發(fā)的進(jìn)展及在研發(fā)過程中的變更情況進(jìn)行必要的方法再驗證，以不斷完善分析方法，同時適用于變更后產(chǎn)品的質(zhì)量控制。