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高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥，繼續加熱，此時由于蒸氣不能溢出，而增加了滅菌鍋內的壓力，從而使沸點增高，得到高于100℃的溫度。導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。
如果操作不當，即達不到預期的滅菌效果。在操作高壓滅菌器有以下幾點注意事項
1、汽未放盡前，不得開啟高壓鍋；
2、如果滅菌后的培養基在鍋內不及時拿出，需在蒸汽放盡后將鍋蓋打開，切忌將培養基封閉在鍋內過夜。
3、壓力表指針在0.05MPa以上時，不能過快放汽，以防止壓力急速下降，液體滾沸，從培養容器中溢出。
4、操作過程，請注意安全，小心燙傷。
在一個標準大氣壓下水的沸點是100攝氏度，壓力越高,與之對應壓力下的沸點越高，這里是高壓蒸汽鍋,說明壓力肯定大于一個標準大氣壓(通常情況下的地表面的大氣壓強就認為是一個標準大氣壓)，也就是說高壓蒸汽鍋肯定要超過100攝氏度才能沸騰，才能產生蒸汽。至少要等到水煮沸，排出一分鐘左右的蒸汽后再把安全閥關閉，這樣可以使高壓蒸汽鍋里的壓力迅速上升，原來沸騰的水因為壓力的快速上升而停止沸騰，壓力大，沸點高，水蒸汽就變成液體水，而放出大量的汽化潛熱，就是高溫高壓的目的，從而達到殺菌的目的。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：
一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質較易凝固，因蛋白質含水量增加，所需凝固溫度降低；
二是濕熱的穿透力比干熱大；
三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100℃時，由氣態變為液態時可放出2.26kJ(千焦)的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。
在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排除是否干凈極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養基而發生污染。要100度以上，也就是對應壓力下的沸點后才能使水劇烈沸騰，將鍋內空氣更多的排除。
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