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雙光束分光光度計經單色器分光后經反射鏡分解為強度相等的兩束光，一束通過參比池，一束通過樣品池。光度計能自動比較兩束光的強度，此比值即為試樣的透射比，經對數變換將它轉換成吸光度并作為波長的函數記錄下來。
雙光束分光光度計一般都能自動記錄吸收光譜曲線。由于兩束光同時分別通過參比池和樣品池，還能自動消除光源強度變化所引起的誤差。
雙波長分光光度計由同一光源發出的光被分成兩束，分別經過兩個單色器，得到兩束不同波長1和2的單色光；利用切光器使兩束光以一定的頻率交替照射同一吸收池，然后經過光電倍增管和電子控制系統，最后由顯示器顯示出兩個波長處的吸光度差值。對于多組分混合物、混濁試樣（如生物組織液）分析，以及存在背景干擾或共存組分吸收干擾的情況下，利用雙波長分光光度法，往往能提高方法的靈敏度和選擇性。利用雙波長分光光度計，能獲得導數光譜。
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