（引用文獻）

J. Camperi et al., Physicochemical and Functional Characterization of Differential CRISPR-Cas9 Ribonucleoprotein Complexes, Anal. Chem. 2022, 94, 2, 1432–1440, CC BY NC ND

（要點）

這是一項革新性的生物技術：與DNA的重復序列CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）相關的基因組DNA切割酶（CRISPR-associated protein; Cas）和單分子向導RNA（sgRNA）形成復合物（RNP），識別DNA上特定的堿基序列，進行精準剪切甚至修復。這項技術在基因治療藥物、農作物的基因改變以及診斷試劑等多個領域中的應用開發正在不斷推進中。

文獻作者等研究人員利用超高性能尺寸排阻色譜（UP-SEC）和多種檢測器分析CRISPR/Cas9、sgRNA及其復合物，發現各成分中存在多聚體。另外，還使用陰離子交換色譜（AEC/AEX）分析切割的DNA片段，對CRISPR/Cas9中的酶活性進行了評價。結果發現多聚體會影響復合物的形成，降低酶活性。由此可知色譜分析對CRISPR-Cas、sgRNA等的基因編輯所用試劑的質量評價有效。

● CRISPR-Cas9、sgRNA及其復合物的SEC分離

使用TSKgel UP-SW3000對CRISPR/Cas9、sgRNA及其復合物進行了UP-SEC分析。在各成分及其復合物（分子量約180 kDa）中發現了多聚體，特別是在sgRNA（約100堿基）中發現存在大量二聚體、三聚體和四聚體（參閱下一頁數據）。可以看出這些多聚體對CRISPR/Cas9的復合物形成以及DNA剪切活性有影響。

Ref.: J. Camperi et al., Anal. Chem. 2022, 94, 2, 1432–1440, CC BY NC ND

● sgRNA的多聚體分析及CRISPR/Cas9的DNA剪切活性

在分析sgRNA的多聚體時，串聯2支TSKgel UP-SW3000，通過UP-SEC進行更細致的分析。結果發現對sgRNA進行70℃的熱處理時多聚體會消失，幾乎變為單體，在CRISPR/Cas9的復合物中，多聚體也會減少。另外，在使用AEC/AEX分析DNA片段時還發現，如果使用熱處理后的sgRNA，CRISPR/Cas9的DNA剪切活性也會提高。

Ref.: J. Camperi et al., Anal. Chem. 2022, 94, 2, 1432–1440, CC BY NC ND

● 總結、考察

使用UP-SEC色譜柱，可對CRISPR/Cas9和sgRNA的多聚體等物理特性進行高分辨率分析。另外還發現，可以通過使用AEC/AEX分析DNA片段，來評價CRISPR/Cas9的DNA剪切活性。由此可知，在醫療領域的應用中，對基因編輯試劑CRISPR/Cas9和sgRNA的質量管理、酶活性的評價中，UP-SEC和AEC/AEX是非常有效的分析手段。

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