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細胞外囊泡（Extracellular Vesicles; EVs）是由細胞中釋放出來的小囊泡。近年來的研究表明，EVs含有mRNA和miRNA，并具有細胞間的信息傳遞功能。特別是直徑約30～150 nm的EVs，也就是外泌體，已被發現與細胞的活性化、不活性化以及免疫調控有關。另外，由于癌細胞的EVs與細胞轉移及癌變有關，所以除了在診斷和治療預后階段可作為腫瘤標志物進行檢查以外，研發人員還對其是否可應用于給藥系統（DDS）進行著相關研究。
EVs的分離和純化常會用到液相色譜法，其中尺寸排阻色譜（SEC）廣受關注。下表分別是EVs分析方法及其特點的對比、分析EVs時使用的色譜分離模式，以及適用的SEC色譜柱。
● 細胞外囊泡（EVs、外泌體）的分析方法及其特點
分離方法 | 尺寸排阻色譜 (SEC) | 超速離心分離 (dUC) | 超濾膜 (UF) | 聚乙二醇(PEG) 沉淀 | 免疫親和 (IA) | 微通道反應器 (MF) |
分離原理 | 分子尺寸 | 分子尺寸、密度 | 分子尺寸 | 表面電荷、溶解性 | 標志物分子對抗體的 特異性吸附 | 免疫親和密度、 分子尺寸 |
特異性 | ＋＋ | ＋＋ | ＋ | ＋ | ＋＋＋ | ＋＋＋ |
回收率 | ＋＋＋ | ＋＋ | ＋＋ | ＋＋＋ | ＋＋ | ＋ |
純度 | ＋＋＋ | ＋＋＋ | ＋ | ＋ | ＋＋＋ | ＋＋＋ |
樣品載量 | ＋＋＋ | ＋＋ | ＋＋ | ＋ | ＋＋ | ＋ |
短時分析 | ＋＋＋ | ＋＋ | ＋ | ＋＋ | ＋ | ＋＋ |
成本優勢 | ＋＋＋ | ＋ | ＋＋ | ＋＋＋ | ＋ | ＋ |
操作便捷性 | ＋＋＋ | ＋＋ | ＋＋＋ | ＋＋＋ | ＋＋ | ＋ |
分離效率 | ＋＋＋ | ＋＋ | ＋＋ | ＋＋ | ＋＋ | ＋＋＋ |
放大 | ＋＋＋ | ＋＋ | ＋＋ | ＋＋＋ | ＋ | ＋ |
評價基準：＋（低）、＋＋（中）、＋＋＋（高，涂色處）
Ref.：K. Sidhom et al., A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option? Int. J. Mol. Sci. (2020) Sep 4;21(18):6466, CC BY，更改了部分數據
● 分析、分離細胞外囊泡（EVs）時使用的色譜分離模式
分離模式 | 分離原理 | 優點 | 缺點 | 主要分離條件 |
尺寸排阻色譜 （SEC） | 分子尺寸 | ·蛋白質、核酸等的分離 ·用于分析和純化 | ·樣品載量少 ·混入脂蛋白（VLDL） | ·在接近中性的洗脫液中進行等度分離 |
離子交換色譜 （IEC） | 靜電相互作用 （EVs帶負電） | ·樣品載量多，用于純化 ·可分離VLDL等物 | ·需要進行脫鹽、稀釋等預處理 | ·在pH值接近中性的洗脫液中進行鹽梯度分離 |
混合模式色譜 （MXC） | 靜電相互作用 疏水性相互作用 | ·可分離VLDL等物 ·用于預處理、純化 | ·需要進行脫鹽、稀釋等預處理 ·難以設定分離條件 | ·在pH值接近中性的洗脫液中進行鹽梯度分離 ·也可使用耐鹽性IEC |
● 分析細胞外囊泡（EVs）時使用的尺寸排阻色譜柱
可以分析的 EVs的大小和直徑 | 色譜柱的 填料孔徑 | 可使用的SEC色譜柱等級 | 備注 | 文獻 |
10 - 200 nm | ＞100 nm | TSKgel G6000PWXL, G-DNA-PW (TSKgel SuperAW6000, a-6000) | ·可能會存在200 nm的EVs被排阻的情況 ·也可以串聯使用TSKgel G6000PWXL＋G4000PWXL | 1, 2 |
10 - 100 nm | 100 nm | TSKgel G5000PWXL (TSKgel SuperAW5000, a-5000) | ·可能會存在100 nm的EVs被排阻的情況 | 3 |
10 - 50 nm | 50 nm | TSKgel G4000PWXL, (a-4000, SuperAW4000) TSKgel G4000SWXL, UltraSW Aggregate TSKgel UP-SW Aggregate | ·可能會存在50 nm的EVs被排阻的情況 ·也可以串聯使用TSKgel G6000PWXL＋G4000PWXL | 4, 5 |
● 細胞外囊泡（EVs）的分離示例
Column : TSKgel G6000PW (7.5 mm I.D. x 30 cm) Elution : PBS Flow rate : 1.0 mL/min Detection : UV(210 nm), LS Temperature : Room temperature Sample : Erythrocyte Extracellular vesicles Ref.: Z. Varga et al., Towards traceable size determination of excellular vesicles, | Column : TSKgel G4000SWXL (7.8 mm I.D. x 30 cm) Elution : 20 mmol/L phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.15 mol/L NaCl Flow rate : 0.5 mL/min Detection : UV(220 nm), LS Temperature : 25℃ Sample : Mesenchymal stem cell (MSC) cultured medium after 24, 48, 72 hr Ref.: S.S.Tan et al., Therapeutic MSC exosomes are derived from lipid raft microdomains in the plasma membrane, J. Extracellular Vescicles, 2 (2013) 22614, CC BY. |
● 使用TSKgel色譜柱分析EVs的相關文獻，以及與EVs有關的總論和指南
1. Z. Varga et al., Towards traceable size determination of excellular vesicles, J. Extra cell. Vesicles, 3 ( 2014) 23298, CC BY.
2. G. E. Benedetto et al., Multiple Techniques for Size Determination of Generalized Modules for Membrane Antigens from Salmonella typhimurium and Salmonella enteritidis, ACS Omega 2017, 2, 11, 8282–8289.
3. R. M. M. da Silva, A chromatography approach towards large-scale purification of mesenchymal stem/stromal cell-derived extracellular vesicles, (2020) Instituto Superior Técnico, Lisboa
4. S. S. Tan et al., Therapeutic MSC exosomes are derived from lipid raft microdomains in the plasma membrane, J. Extracellular Vescicles, 2 (2013) 22614, CC BY.
5. K. Vrabec et al., Emerging tools for exosome: Purification and in-process monitoring, BioProcess International, 17(3)E1, March 2019
6. 《研究開發鳥瞰報告書》，2.4.2 細胞外微粒子、細胞外囊泡、生命科學和臨床醫學領域(2021), p499.
7. C. Thery et al., Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of MISEVE2014 guideline, J. Extracellular Vesicles, 2018 Vol 7, 1535750.
8. K. Sidhom et al., A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option?
Int. J. Mol. Sci. 2020 Sep 4;21(18):6466.
9. H. Kaddour et al., The past, present, and future of the size exclusion chromatography in extracellular vesicles separation,
Viruses, November 2021, 13(11):2272.
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