靶向細(xì)胞因子自身免疫性疾病藥物開發(fā)

隨著對(duì)自身免疫病和炎癥性疾病發(fā)病機(jī)制的深入研究，有越來越多的新靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，如內(nèi)體/溶酶體相關(guān)蛋白、microRNA，而細(xì)胞因子毫無疑問占據(jù)非常重要的地位，經(jīng)典的自身免疫病和炎癥相關(guān)靶點(diǎn)通路以TNF、IL-17/IL-23、IL-4/IL-13等為代表。此外還有如IL-1β、IL-5、IL-36、IL-39等均可能成為某些自身免疫病的干預(yù)靶點(diǎn)。如治療哮喘的生物制劑中，Mepolizumab（美泊利單抗）和Reslizumab（瑞替珠單抗）是抗IL -5抗體。Benralizumab（貝那利珠單抗）結(jié)合IL-5受體α的α鏈。Dupilumab（度普利尤單抗）結(jié)合到IL-4R的α亞基。

治療哮喘的抗體藥作用機(jī)制

圖片來自Allergy. 2020Jul;75(7):1582-1605.

更好地了解自身免疫病的發(fā)病機(jī)理，以及在這些疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用的特定細(xì)胞因子模式，有助于我們設(shè)計(jì)靶向治療策略。

借助IsoPlexis單細(xì)胞分泌蛋白組技術(shù)，可以對(duì)分泌細(xì)胞因子的各種免疫細(xì)胞，在單細(xì)胞水平上的分子作用機(jī)制進(jìn)行更深入的探索，挖掘各種自身免疫疾病在發(fā)病、疾病進(jìn)展和緩解過程中的細(xì)胞和分子機(jī)制變化，為藥物開發(fā)提供強(qiáng)有力的依據(jù)，同時(shí)可也幫助發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物，為開發(fā)自免病療法保駕護(hù)航。

圖示IsoPlexis單細(xì)胞功能蛋白組技術(shù)檢測原理

IsoPlexis單細(xì)胞分泌蛋白組技術(shù)

IsoPlexis單細(xì)胞分泌蛋白組技術(shù)，實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞水平對(duì)免疫細(xì)胞分泌的多達(dá)32種細(xì)胞因子進(jìn)行分析，找到在免疫應(yīng)答反應(yīng)中具有作戰(zhàn)能力的“超級(jí)英雄細(xì)胞”。

通過“細(xì)胞多功能指數(shù)（PSI）”更地分析免疫細(xì)胞的綜合功能，以加深對(duì)免疫相關(guān)疾病的作用機(jī)制研究，推進(jìn)免疫相關(guān)療法的開發(fā)，用于腫瘤、抗感染、自身免疫病等領(lǐng)域。

在多種自身免疫性疾病研究中，常常發(fā)現(xiàn)病人體內(nèi)存在各種類型的多功能免疫細(xì)胞（T細(xì)胞、單核細(xì)胞等），多功能T細(xì)胞是指能同時(shí)分泌兩種及以上細(xì)胞因子的細(xì)胞，它們往往比單功能細(xì)胞（只分泌一種細(xì)胞因子）介導(dǎo)更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，從而與自身免疫病的發(fā)生或進(jìn)展密切相關(guān)。

嚴(yán)控強(qiáng)制捕撈

“多功能細(xì)胞”在自身免疫性疾病中的作用

美國康涅狄格州三一學(xué)院（Trinity College）分子風(fēng)濕病學(xué)系的Ursula Fearon教授研究團(tuán)隊(duì)2022年在Annals of the Rheumatic Diseases 期刊（影響因子：19.103）發(fā)表以下文章，探討類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (RA)、高危個(gè)體 (IAR) 和健康對(duì)照 (HC) 人群中滑膜組織活檢中的致病性和保護(hù)性多功能T細(xì)胞反應(yīng)，并確定在臨床炎癥發(fā)展之前在RA關(guān)節(jié)中富集的新的致病性多功能T細(xì)胞群的存在。

研究方法：

對(duì)來自風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA，n=118）、高危個(gè)體（IAR，n=20）和健康人（HC，n=44）的滑膜活檢樣本進(jìn)行單細(xì)胞多組學(xué)分析，包括RNAseq和流式細(xì)胞分析。

研究結(jié)果：

1.在RA患者滑膜組織中，Tfh細(xì)胞可塑性增加，CD4 T細(xì)胞多功能性增強(qiáng)，Treg細(xì)胞記憶反應(yīng)增強(qiáng)。

2. 滑膜組織RNAseq分析顯示，T細(xì)胞激活和分化途徑的富集早于RA疾病前發(fā)生。

3. 在IAR和RA患者的滑膜組織中，由IL-4和GM-CSF主導(dǎo)的潛在保護(hù)性多功能性CD4 T細(xì)胞反應(yīng)向致病性多功能性T細(xì)胞反應(yīng)轉(zhuǎn)變明顯。

4. 聚類分析顯示，高度多功能性CD4+ CD8dim T細(xì)胞在IAR和RA中累積，而在健康人滑膜組織中沒有。CD4+ CD8dim T細(xì)胞顯示氧化磷酸化利用增加，這是代謝啟動(dòng)的記憶T細(xì)胞的特征。滑膜CD4+ CD8dim T細(xì)胞頻率與RA疾病活性相關(guān)。

研究結(jié)論：

從潛在保護(hù)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏⌒訲細(xì)胞多功能性早于RA臨床炎癥的發(fā)作，為RA的治療干預(yù)提供了機(jī)會(huì)。

克羅恩病

克羅恩病是炎癥性腸病的一種，屬于原因不明的腸道炎癥性疾病，是多種因素引起易感人群的自身免疫反應(yīng)。由于克羅恩病的病因尚未明確，所以疾病仍然難以攻克。研究疾病的發(fā)病機(jī)制，能夠讓醫(yī)療人員有針對(duì)的制定相關(guān)的治療方案，對(duì)于病人的治療非常關(guān)鍵。

來自加州大學(xué)洛杉磯分校大衛(wèi)·格芬醫(yī)學(xué)院的Jonathan Braun教授研究團(tuán)隊(duì)探討了NK細(xì)胞多功能性在克羅恩病中的作用，研究成果“Human Natural Killer Cells Licensed by KIR Genes Have an AlteredCytokine Program That Modifies CD4+ T Cell Function”發(fā)表在Journal of Immunology期刊上。

研究方法：

作者采用微流控單細(xì)胞條形碼芯片（SCBC）在單細(xì)胞水平評(píng)估單個(gè)NK細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌譜，分析了數(shù)千個(gè)NK單細(xì)胞和分泌的多種蛋白，以研究NK細(xì)胞的多功能性，及在不同疾病條件下介導(dǎo)的保護(hù)性和炎性免疫反應(yīng)異質(zhì)性。

研究結(jié)果：

1. NK細(xì)胞“許可”（licensing）由宿主基因組中KIR2DL3和純合子HLA-C1的存在決定，導(dǎo)致NK細(xì)胞的細(xì)胞因子重編程，并促進(jìn)CD4+ T細(xì)胞活化和體外Th17分化。

2. 單細(xì)胞微流控蛋白組分析表明，“經(jīng)許可”的NK細(xì)胞比“未許可”的NK細(xì)胞具有更高的多功能性，表現(xiàn)為更傾向于產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，包括IFN-γ、TNF-α、CCL-5和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)-1β的產(chǎn)生。

3. “經(jīng)許可”NK細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子增加了CD4+ T細(xì)胞的增殖和IL-17A/IL-22的產(chǎn)生。抗體阻斷實(shí)驗(yàn)表明IFN-γ、TNF-α和IL-6在增強(qiáng)T細(xì)胞增殖反應(yīng)中起主要作用。

研究結(jié)論：

由KIR2DL2/3和HLA-C1介導(dǎo)的“NK許可”誘導(dǎo)了一種新的NK細(xì)胞因子程序，增強(qiáng)NK細(xì)胞多功能性，并可激活誘導(dǎo)促炎CD4+ T細(xì)胞，從而為KIR相關(guān)的克羅恩腸病等慢性炎癥疾病的易感性提供了一種新的生物學(xué)機(jī)制可能性。

多發(fā)性硬化

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)炎性脫髓鞘病變?yōu)橹饕攸c(diǎn)的自身免疫病，病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未明確。既往對(duì)MS的研究重點(diǎn)主要集中適應(yīng)性免疫在MS發(fā)病機(jī)制和治療中的作用，而關(guān)于天然免疫在MS中的作用的文獻(xiàn)相對(duì)較少。

來自美國康涅狄格大學(xué)免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)系的R. B. Clark研究團(tuán)隊(duì)探討了天然免疫在多發(fā)性硬化發(fā)病中的作用機(jī)制，發(fā)表題為“Enhanced TLR2 responses in multiple sclerosis”的文章。

研究結(jié)果：

1. 在MS病人體內(nèi)可能缺乏微生物誘導(dǎo)的天然免疫調(diào)節(jié)功能，導(dǎo)致對(duì)TLR2反應(yīng)增強(qiáng)，從而在疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。

2. MS對(duì)TLR2的反應(yīng)增強(qiáng)主要來自單核細(xì)胞，在MS病人外周血單核細(xì)胞的多功能性及多功能指數(shù)（PSI）顯著高于健康對(duì)照者，起主要作用的細(xì)胞因子是IL-8。PSI可作為判斷MS病人的一個(gè)潛力檢測指標(biāo)。

3. 在治療后，單核細(xì)胞的多功能性顯著下調(diào)，提示PSI有可能作為預(yù)測MS治療反應(yīng)的一個(gè)指標(biāo)。

研究結(jié)論：

單細(xì)胞分泌蛋白組技術(shù)幫助研究人員深入解析單個(gè)免疫細(xì)胞的功能表型和評(píng)估免疫功能狀態(tài)，為進(jìn)一步揭示MS疾病的細(xì)胞作用機(jī)制和治療提供一個(gè)有潛力的生物標(biāo)志物。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種多發(fā)于青年女性的累及多臟器的自身免疫性和炎性結(jié)締組織病，本病病因至今尚未肯定，其發(fā)病可能與遺傳、內(nèi)分泌、感染、免疫異常和一些環(huán)境因素有關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)濾泡輔助性T（Tfh）細(xì)胞在B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞分泌免疫球蛋白過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在SLE小鼠模型或SLE患者體內(nèi)都可觀察到Tfh細(xì)胞的異常擴(kuò)增。以Tfh細(xì)胞為新的治療靶點(diǎn)可能成為治療包括SLE在內(nèi)的自身免疫性疾病的重要方法。

研究結(jié)果：

1. 比較不同T細(xì)胞亞群細(xì)胞的功能特性：Na?ve T細(xì)胞，中央記憶性T細(xì)胞（Tcm），和濾泡輔助性T細(xì)胞（Tfh），有助于發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用的細(xì)胞亞群和作用機(jī)制。

2. 在系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人中可見多功能性T細(xì)胞增多，其中產(chǎn)生B細(xì)胞輔助因子IL-21和效應(yīng)因子IL-2、IFN-γ和TNF-α分泌水平增高。

研究結(jié)論：

在系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人身上，Tfh細(xì)胞的多功能性（IL-21+ IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+）顯著增強(qiáng)，從而可能通過影響B(tài)細(xì)胞功能而誘導(dǎo)疾病發(fā)生。

靶向細(xì)胞因子自身免疫性疾病藥物開發(fā)

不論是流式細(xì)胞分析，還是EliSpot技術(shù)，在檢測分泌細(xì)胞因子的多功能細(xì)胞時(shí)往往一次只能檢測3-5種細(xì)胞因子，而無法進(jìn)行更廣泛、更深入的研究。

利用IsoPlexis單細(xì)胞分泌蛋白組技術(shù)，結(jié)合IsoCode Human Inflammation單細(xì)胞芯片，可對(duì)分泌不同細(xì)胞因子的T細(xì)胞亞群（Th1、Th2、Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞等）在單細(xì)胞水平進(jìn)行更的綜合性分析，一次分析多達(dá)32種細(xì)胞因子，便于：

★ 評(píng)估疾病不同階段病人體內(nèi)的免疫狀態(tài)，并為早期干預(yù)提供可能

★ 發(fā)現(xiàn)以往因?yàn)榧夹g(shù)局限而無法觸及的新發(fā)現(xiàn)，推進(jìn)醫(yī)學(xué)發(fā)展

★ 為自身免疫性疾病的藥物開發(fā)提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)新靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物

IsoCode Human Inflammation芯片可檢測細(xì)胞因子種類