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在進行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養物。得到純培養的過程稱為分離純化.蛋白的分離純化常見方法，離子交換、分子篩、疏水層析、親和層析等，
在分離純化過程中多種外部因素都會導致抗原發生結構變化。
1. 溫度
由于蛋白質結構的復雜性，找不到一個能描述溫度和蛋白質結構功能之間關系的一般性機理。但一般來說，溫度越高，蛋白質越不穩定。在分離純化過程中如果溫度過高，長時間的純化過程可能導致抗原的降解，因此某些純化過程往往在低溫條件下進行。但溫度也并不是越低越好，溫度會影響分離純化的效果。例如在疏水作用層析中，溫度的降低可能導致抗原與填料的結合能力減弱，發生穿透。此外，低溫環境控制同樣帶來能耗的增加。
2. pH值
溶液pH決定了蛋白質的電荷性，因此會影響靜電作用。靜電作用一方面會影響疫苗抗原自身的穩定性：首先，當pH遠離蛋白質的等電點時，隨著溶液酸性或堿性的增強，帶電荷的基團數目增多，折疊態上的電荷密度高于去折疊態，使得蛋白質折疊態不穩定；其次，
電荷同樣會增強蛋白質分子間的靜電作用。例如病毒及病毒樣顆粒(VLPs)疫苗，當顆粒有強電荷性時，蛋白質分子間的排斥作用有利于穩定蛋白質的膠體性質，但由于病毒及VLPs是由許多亞基組成的，數量可達上百，且可能是由幾種不同的結構蛋白組成，亞基之間的靜電排斥可能造成顆粒的組裝結構的不穩定甚至解聚。另一方面，靜電作用也會影響與純化過程中界面的相互作用。
3. 鹽
鹽對蛋白質穩定性的影響比較復雜。根據鹽的類型和濃度、離子作用的性質、蛋白質中的帶電殘基，鹽對蛋白質可能起到穩定、破壞穩定或者無任何影響等效果。鹽對蛋白質穩定性的凈作用是鹽與蛋白質直接作用以及對蛋白質分子間作用影響的綜合結果。由于pH影響蛋白質的電荷類型、總量及分布，因此鹽的作用還可能受pH的影響。由此可見，鹽的種類及濃度對疫苗抗原穩定性的影響需要系統的考察。
4.振動和剪切
振動產生疏水的空氣/水界面可以導致蛋白質分子在界面處的富集，進而發生變性，使得暴露在空氣中的疏水殘基大化，并且還會引起蛋白質的聚集。剪切也可以暴露蛋白質的疏水區域，引起蛋白質的聚集。在切向流超濾過程中，溶液以一定流速流過膜表面，流速越高，濃度極化的程度越小，但是剪切力增加。
5.界面
在分離純化過程中，固液界面上的吸附既是實現疫苗抗原純化的一個重要作用，也是導致其變性的關鍵因素之一。
在膜過濾過程中，超濾膜的材質一般為纖維素、聚砜、聚偏氟乙烯等有機聚合物膜。這些膜的表面具有較強的疏水性，蛋白質很容易吸附在這些膜的表面上。目前，商品化膜的表面都經過修飾，從而具有較好的親水性，使得蛋白質在膜上的吸附大大降低，但是不能*避免蛋白質在膜表面的疏水性吸附。另外，膜的表面一般都帶有少量的負電荷，由于靜電相互作用，帶正電的物質會吸附在膜表面。一般來說，吸附在膜表面的蛋白質容易發生變性，導致其生物活性發生變化。
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