組織總RNA小量提取試劑盒的操作步驟與應用！

一、背景

組織總RNA小量提取試劑盒用于動物組織，細胞，老鼠尾巴，石蠟包埋組織基因組DNA提取，硅膠膜純化技術，限度去除蛋白質，多糖，脂類等雜質，純度高，整個提取過程無需乙醇沉淀和酚/氯仿抽提。組織總RNA小量提取試劑盒可從多種細胞和組織中快速進行總RNA柱式純化。小于20分鐘的高質量RNA；從單一的提取物中純化高達1,000微克的RNA；無害組織（酚/氯仿）提取液裂解。使用組織總RNA小量提取試劑盒分離獲得的總RNA可用于需要高質量的總RNA的多種下游應用領域。

二、操作步驟

1、將組織在液氮中磨碎成粉沫。每20~30mg組織加600ulBufferRL（使用前檢查是否加入β-巰基乙醇），組織樣本少于20mg加350ulBufferRL。樣品體積不超過BufferRL體積的十分之一。

2、樣品充分裂解后，室溫放置5min，使蛋白核酸復合物*分離。

3、12000rpm離心2~5min，取上清進行下步操作。

4、加入1倍體積（600ul或350ul）的70%乙醇（無RNase水配制），混勻。

5、將步驟4所得溶液全部加入到已裝入收集管（CollectionTube2ml）的吸附柱（SpinColumnCR）中，若一次不能將全部溶液加入吸附柱中，請分兩次轉入，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

6、向吸附柱中加入350μlBufferRD，10000rpm離心15sec，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

7、配制DNaseI混合液：取52ulDEPC-H2O，向其中加入8ul10×DNaseIBuffer和20ulDNaseI（1U/ul），混勻，配制成終體積為80ul的DNaseI混合液。

8、向吸附柱中直接加入80ulDNaseI混合液，20~30℃孵育15min。

9、向吸附柱中加入350ulBufferRD，10000rpm離心15sec，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

10、向吸附柱中加入500ulBufferRW，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

11、重復步驟10。

12、12000rpm離心2min，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數分鐘，以*晾干。

13、將吸附柱置于一個新的無RNase離心管（CollectionTube1.5ml）中，向吸附柱的中間部位懸空加入30~50ulDEPC-H2O，室溫放置1min，12000rpm離心1min，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

三、應用

可用于奶牛乳腺組織中miRNA表達譜研究以及與泌乳相關miRNA的鑒定：

miRNA是一類長約22個核苷酸(nt)的小分子非編碼RNA,它能使nRNA降解或蛋白翻譯抑制而起調控基因的作用,目前在生命活動的各個過程中都有相關niRNA的報道。奶牛乳腺泌乳是一個重要的生理過程,但是關于miRNA對其調控的研究卻不多。本研究采用Solexa高通量測序技術獲得奶牛乳腺泌乳期和非泌乳的niRNA序列,用基因芯片和real-time PCR方法分析泌乳期和非泌乳期miRNA的表達差異。

采用生物信息學技術預測這些miRNA可能的靶基因,構建以泌乳為中心的miRNA調控網絡圖。最后研究了miR-484通過己糖激酶對糖代謝過程的調控。主要研究結果如下：

1、奶牛乳腺組織中niRNA的高通量測序為了獲得奶牛乳腺組織中的miRNA,分別構建奶牛泌乳期與非泌乳期乳腺組織RNA文庫,用Solexa高通量測序技術分別測序,共獲得15,089,573條與18,079,366條原始讀數,過濾低質量、重復等序列后有11,964,909條與15,968,116條純凈序列用于后續分析。分析其長度分布,發現有超過一半的純凈序列在22nt,證明測序可靠。

2、奶牛乳腺組織miRNA的鑒定和特征分析本部分主要是對獲得的測序序列進行整理、歸類和分析,挖掘miRNA的特征。對得到的純凈序列進行比對分類,共發現有885條pre-miRNA編碼921條成熟體niRNA,在這些成熟體中有884條是序列。這些序列中有283條已知miRNA,96條與其他物種同源的miRNA,還有505條新發現的miRNA是。同時還分析了885條pre-miRNA在?；蚪M上的定位,共有800條pre-miRNA能與?；蚪M比對上,其中230條pre-miRNA能組成55個基因簇。

3、泌乳期和非泌乳期奶牛乳腺中miRNA表達差異譜分析及功能預測本部分主要研究泌乳期和非泌乳期奶牛乳腺組織中miRNA表達差異,并對已知miRNA進行靶基因預測,最終構建調控網絡。