革蘭氏染色液試劑盒的檢驗原理與操作步驟！

一、背景

革蘭氏染色液試劑盒可用于細菌的革蘭氏染色試驗。革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，通過結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌細胞壁較厚，肽聚糖網層次較多且交聯致密，乙醇脫色時，肽聚糖脫水使孔徑縮小，故保留結晶紫-碘復合物在細胞膜上，呈紫色。革蘭氏陰性菌細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差，脫色后類脂外膜迅速溶解，縫隙加大，結晶紫與碘復合物溶出，因此乙醇脫色后再經番紅復染，呈紅色。

二、檢驗原理

通過結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現縫隙，因此，能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

三、操作步驟

1、涂片固定：菌液涂片時不可過于濃厚，干燥、固定。固定時通過火焰1-2次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。

2、染色：一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：

(1)加上結晶紫后，染色1分鐘，水洗。

(2)加上碘液后染色1分鐘，水洗。

(3)加上95%酒精，搖動玻片，根據涂片厚度，脫色約20-60秒，水洗，吸去水分。

(4)加上番紅后，染色1分鐘，水洗。

(5)吸干或在空氣中涼干后，油鏡鏡檢。

革蘭氏染色的關鍵在于嚴格掌握酒精脫色程度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時，陰性菌可被誤染為陽性菌。此外，菌齡也影響染色結果，如陽性菌培養時間過長，或已死亡及部分菌體自行溶解，都常呈陰性反應。

3、結果觀察：革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。以均勻分散開的細菌的革蘭氏染色反應為準，過于密集的細菌，常常呈現假陽性。

四、應用

用于兩株革蘭氏染色性質不同的細菌促進碳酸鹽礦物形成的對比研究：

利用Bacillus cereus LV-1菌株（G+）和Curvibacersp.HJ-1菌株（G-）在相同培養基中分別進行為期30d的培養實驗,同時利用胞外聚合物進行了120 h的氣體擴散實驗,測定了溶液的pH值、電導率、離子濃度、胞外多糖含量、碳酸酐酶活性、礦物種類和形態及其碳同位素組成等。

研究結果可以概括為以下幾點：（1）LV-1菌株和HJ-1菌株均具有在不含CO32-的培養基中誘導碳酸鹽礦物形成的能力。前者在第30 d時形成的礦物總質量為26.5 mg,晶體尺寸約為40μm;后者在第30d時形成的礦物總重量為14mg,晶體尺寸約為6μm。

（2）在Mg/Ca=1的培養基中兩株細菌均誘導形成方解石;在Mg/Ca=5的培養基中主要誘導形成碳鈣鎂石。

（3）LV-1菌株和HJ-1菌株誘導形成的礦物在形態上存在較大差異。前者形成的方解石主要呈不規則狀和立方體狀;碳鈣鎂石呈柱狀、塊狀和球狀。后者形成的方解石主要呈短桿狀、啞鈴狀、球狀;碳鈣鎂石呈六面體狀、不規則狀和長板狀。

（4）革蘭氏染色性質不同的細菌均誘導形成方解石,不同的是,革蘭氏陰性菌HJ-1菌株更易作為礦物的成核模板,導致啞鈴狀礦物的形成。革蘭氏陽性菌LV-1菌株更易導致不規則狀礦物的形成。

（5）微生物代謝影響礦物中碳同位素組成。細菌介導的方解石δ13C=-17.410‰與胰蛋白胨的δ13C=-14.704‰比較接近,這說明碳酸鹽礦物沉淀的碳主要來源于胰蛋白胨。

（6）胞外聚合物對碳酸鹽礦物種類和形態的影響。LV-1菌株分泌的胞外聚合物有利于高鎂方解石的形成,且大多數呈花菜狀;HJ-1菌株分泌的胞外聚合物有利于文石的形成,文石呈棱柱狀、半球狀。

（7）培養液中的pH值與礦物質量呈顯著正相關關系,Ca2+濃度與礦物質量呈顯著負相關關系,說明較高的pH值即溶液的堿性環境有利于碳酸鹽礦物的形成,且Ca2+濃度的下降可間接地指示礦物的生成。