色譜柱是高效液相色譜儀最主要的部件，被測物質能否被很好的分離和測定，色譜柱的性能起著決定性的作用，因此，應特別注意色譜柱的活化環節，此外色譜柱的日常維護也很重要，有效地維護可以延長色譜柱的使用壽命。

液相色譜的柱子通常分為正相柱和反相柱。正相柱大多以硅膠為柱，或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團的鍵合相硅膠柱;反相柱填料主要以硅膠為基質，在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團(ODS)稱為C18柱，其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等。另外還有離子交換柱，GPC柱，聚合物填料柱等。

色譜柱的活化

新的液相色譜柱都是保存在一定的保存液中的，所謂的活化就是替換掉其中的保存液，沖洗掉柱中可能殘留的其他雜質，以免影響后續分析工作。液相色譜柱的活化方法因柱子而異。

反相色譜柱：使用新的C18柱時，先用甲醇或乙-腈沖洗20-30個柱體積，然后用甲醇/乙-腈：水(50:50)沖洗10個柱體積，然后再用流動相平衡10-30柱體積。

正相色譜柱：新柱用流動相平衡20-30個柱體積。

離子色譜柱(SAX, SCX)：新柱先用100%甲醇或乙-腈沖洗20個柱體積，然后轉換到流動相平衡。

不同的色譜柱活化的方法不盡相同，要根據柱子的種類來選擇活化方法。另外，要提醒的是，柱子活化時不要接檢測器，避免不必要的污染。

液相色譜柱的維護

色譜柱的維護有一定的程序：色譜柱的平衡、色譜柱的再生、最后才是色譜柱的維護。

1、色譜柱的平衡

反相色譜柱由工廠測試后是保存在乙腈/水中的。新柱應先使用10-20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請一定確保您分析樣品所使用的流動相和乙腈/水互溶。每天用足夠的時間以流動相來平衡色譜柱，您就會在處理問題方面獲得最大的"補償"，而且您的色譜柱的壽命也會變得更長!

操作步驟：

a. 平衡開始時將流速緩慢地提高，用流動相平衡色譜柱直到獲得穩定的基線(緩沖鹽或離子對試劑流速如果較低，則需要較長的時間來平衡)

b. 如果使用的流動相中含有緩沖鹽，應注意用純水"過渡"即每天分析開始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動相平衡; 分析結束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護柱子。

2、色譜柱的再生

長期使用的色譜柱，往往柱效會下降(柱子的理論塔板數減低)?？梢詫ιV柱進行再生，在有條件的實驗室應使用一個廉價的泵進行柱子的再生。

選擇再生方法：

極性固定相(如Si，NH2* ，DIOL基色譜填料)的再生：正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水。非極性固定相(如反相色譜填料RP-18，RP-8，CN等)的再生：水→乙腈→氯仿(或異丙醇)→乙腈→水。

注意：

a. 在對NH2改性的色譜柱進行再生時，由于NH2可能以銨根離子的形式存在，因此應該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液*流出。

b. 0.05M稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱，如果簡單的用有機溶劑/水的處理不能夠*洗去硅膠表面吸附的雜質，在水洗后加用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。

3、色譜柱的維護

a.使用預柱保護分析柱(硅膠在極性流動相/離子性流動相中有一定的溶解度);

b.大多數反相色譜柱的pH穩定范圍是2-7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍;

c.避免流動相組成及極性的劇烈變化;

d.流動相使用前必須經脫氣和過濾處理;

e.如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相，應在實驗完畢柱子沖洗干凈，并保存于甲醇或乙腈中;

f.氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接管內不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕。

液相色譜柱的使用注意事項

液相色譜柱的儲存液無特殊說明，均為評價報告所示的流動相。在使用前，一定要注意液相色譜柱的儲存液與要分析樣品的流動相是否互溶。在反相色譜中，如用高濃度的鹽或緩沖液作洗脫劑，應先用10%左右的低濃度的有機相洗脫劑過渡一下，否則緩沖液中的鹽在高濃度的有機相中很容易析出，堵塞色譜柱。

1、流動相

流動相中所使用的各種有機溶劑要盡可能使用色譜純，配流動相的水最好是超純水或全玻璃器皿的雙蒸水。如果將所配得流動相再經過0.45μm 的濾膜過濾一次則更好，尤其是含鹽的流動相。另外，裝流動相的容器和色譜系統中的在線過濾器等裝置應該定期清洗或更換。

但如果您實驗室中同時有液質與液相的話，建議液質的流動相不要輕易過膜，容易出現交叉污染，或者液質使用專門的過膜儀器。

液相與液質混用過膜裝置，導致三乙胺進入質譜，響應突然下降。

以常規硅膠為基質的鍵合相填料通常的pH值適用范圍是2.0-8.0。當必須要在pH值適用范圍的邊界條件下使用色譜柱時，每次使用結束后立即用適合于色譜柱儲存并與所使用的流動相互溶的溶劑清洗，并*置換掉原來所使用的流動相。

不同填料的色譜柱，PH、柱溫的范圍是不一樣的。

2、樣品

樣品也要盡可能清潔，可選用樣品過濾器或樣品預處理柱(spe)對樣品進行預處理;若樣品不便處理，要使用保護柱。在用正相色譜法分析樣品時，所有的溶劑和樣品應嚴格脫水。

一般樣品高速離心就可以了，但需注意取上清時，不要取到下面的沉淀物質以及色譜柱前最好加裝 預柱或在線過濾器。

3、反相液相色譜柱色譜柱每天實驗后的保養

使用緩沖液或含鹽的流動相，實驗完成后應用10%的甲醇/水沖洗30分鐘，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗30分鐘。注意：不能用純水沖洗柱子，應該在水中加入10%的甲醇，防止將填料沖塌陷。

4、長期保存色譜柱

如色譜柱要長時間保存，必須存于合適的溶劑下。對于反相柱可以儲存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲存于嚴格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲存于水(含防腐劑或柳硫汞)中，并將購買新色譜柱時附送的堵頭堵上。儲存的溫度最好是室溫。

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