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超高純度純化單克隆抗體——使用疏水層析填料純化

來源：默隆（上海）實業有限公司 2022年08月30日 09:03

在抗體藥物生產的下游工藝中，一般會在捕獲階段（Protein A親和層析）之后的精制步驟中，采用兩種不同分離模式的層析法進行純化。疏水層析（HIC）是能有效去除多聚體等雜質的分離模式。

I. R. A. P. Bresolin, N. Lingg, I. T. L. Bresolin and A. Jungbauer

Hydrophobic interaction chromatography as polishing step enables obtaining ultra-pure recombinant antibodies

J. Biotechnology: X6 (2020) 100020

（要點）

·在精制步驟中使用HIC填料TOYOPEARL Phenyl-650M，分離純化出了超高純度的抗腫瘤壞死因子抗體（anti-tumor necrosis factor alpha：TNFa、IgG₁）。

·對HIC模式下的吸附等溫線、穿透曲線、層析分離等實施了評估。

·通過HIC純化的抗體的純度是99.9%，回收率是96.2%。并且確認到，抗體組分中混入的多聚體雜質、宿主細胞蛋白（HCP）、DNA都在檢驗要求范圍之內。

·在需要制備超高純度的抗體時，可在下游純化工藝中使用該HIC分離法。

● 抗腫瘤壞死因子抗體（anti-tumor necrosis factor alpha：TNFa、IgG₁）的純化

樣品：抗腫瘤壞死因子抗體（anti-tumor necrosis factor alpha：TNFa、IgG₁）

參照抗體：阿達木單抗 (Adalimumab，商品名：Humira^® )

動態吸附載量（TOYOPEARL Phenyl-650M）：12.05 g/L

色譜柱尺寸：5 mm I.D. × 2.55 cm、駐留時間：2.5 min（流速：0.2 mL/min）

洗脫溶液：20 mmol/L磷酸鈉緩沖溶液（pH 7.4）＋ 1 mol/L 硫酸銨

多聚體的分析、定量：TSKgel^® G3000SWXL

● 使用疏水填料TOYOPEARL Phenyl-650M對抗體進行超高純度純化

（分離出的抗體洗脫峰1和洗脫峰2的純度測定，請繼續閱讀下一頁）

●
對疏水層析（HIC）純化后的抗體（Peak 1）進行純度測定

樣品	濃度 (g/L)^a	抗體純度 (%)^b	多聚體 (%)^c	HCP (ppm)^d	dsDNA (ppb)^e
anti-TNFa IgG1（純化前）	2.00	98.04	1.53	342.5	＜ 0.41^*
anti-TNFa IgG1 + salt（添加樣品）	2.00	98.31	1.55	173.7	＜ 0.41^*
Peak 1（純化組分）	0.96	99.90	＜ 0.06^*	＜ 2.0^*	＜ 0.85^*
Peak 2	0.03	59.88	57.55	＜ 63^*	＜ 27^*
Adalimumab (Humira)	2.00	99.56	0.33	n.d. (181.6)^**	＜ 0.41^*

^a by UV at 280 nm, ^b by SEC at 280 nm, ^c by SEC at 215 nm, ^d ELISA, ^e PCR resDNASEQ^®

* Below lower limit of detection (LLOD), undiluted sample used

** Data from LC/MS/MS by Oliviero et al., Easy, Fast and Reproducible Analysis of Host Cell Protein (HCP) in Monoclonal Antibody Preparations, Application Note (2019)

Ref.: I. R. A. P. Bresolin et al., J. Biotechnology: X6 (2020) 100020

※通過HIC，獲得了比市售抗體藥物阿達木單抗更高純度的抗體組分。

● 抗體純化時HIC填料選擇的要點

·根據抗體的疏水性，選擇疏水性適度的HIC填料（官能團、細孔徑、粒徑等參數的不同），優化抗體的回收率和分離選擇性（去除雜質）

·優化分離時的洗脫條件（緩沖液濃度、pH、鹽濃度、流速、梯度的傾斜度、溫度等）

·設置穩定的線性梯度洗脫條件，使抗體在梯度的中間部分洗脫出來

·HIC填料的疏水性：（低） Ether-650/PPG-600 < Phenyl-650/600 < Butyl-650/600 < Hexyl-650 （高）

● HIC填料和篩選用預裝柱產品一覽表

貨號	產品名稱	粒徑 (mm)	規格^* (mL)	備注
0016173	TOYOPEARL Ether-650M	40 - 90	100	散裝填料（瓶）
0021302	TOYOPEARL PPG-600M	40 - 90	100	散裝填料（瓶）
0014478	TOYOPEARL Phenyl-650M	40 - 90	100	散裝填料（瓶）
0021888	TOYOPEARL Phenyl-600M	40 - 90	100	散裝填料（瓶）
0007477	TOYOPEARL Butyl-650M	40 - 90	100	散裝填料（瓶）
0021449	TOYOPEARL Butyl-600M	40 - 90	100	散裝填料（瓶）
0019956	TOYOPEARL SuperButyl-550C	50 - 150	100	散裝填料（瓶）
0019026	TOYOPEARL Hexyl-650C	50 - 150	100	散裝填料（瓶）
0043276	TSKgel Ether-5PW (20)	15 - 25	25	散裝填料（瓶）
0043176	TSKgel Ether-5PW (30)	20 - 40	25	散裝填料（瓶）
0043277	TSKgel Phenyl-5PW (20)	15 - 25	25	散裝填料（瓶）
0043177	TSKgel Phenyl-5PW (30)	20 - 40	25	散裝填料（瓶）

貨號	產品名稱	粒徑 (mm)	規格 (mL)	備注
0045220	SkillPak TOYOPEARL Ether-650M	40 - 90	1 mL×5支	預裝柱
0045218	SkillPak TOYOPEARL PPG-600M	40 - 90	1 mL×5支	預裝柱
0045217	SkillPak TOYOPEARL Phenyl-650M	40 - 90	1 mL×5支	預裝柱
0045216	SkillPak TOYOPEARL Phenyl-600M	40 - 90	1 mL×5支	預裝柱
0045215	SkillPak TOYOPEARL Butyl-650M	40 - 90	1 mL×5支	預裝柱
0045214	SkillPak TOYOPEARL Butyl-600M	40 - 90	1 mL×5支	預裝柱
0045219	SkillPak TOYOPEARL Hexyl-650C	50 - 150	1 mL×5支	預裝柱
0045233	SkillPak HIC (TOYOPEARL Butyl-650M, Phenyl-650M, PPG-600M, Hexyl-650C, Ether-650M)	-	1 mL×5種×1支	預裝柱
0045234	SkillPak HIC (TOYOPEARL Butyl-600M, Phenyl-600M, PPG-600M, Hexyl-650C, Ether-650M)	-	1 mL×5種×1支	預裝柱
0045235	SkillPak HIC (TOYOPEARL Butyl-650M, Phenyl-650M, PPG-600M)	-	1 mL×3種×2支	預裝柱
0045236	SkillPak HIC (TOYOPEARL Butyl-600M, Phenyl-600M, PPG-600M)	-	1 mL×3種×2支	預裝柱
0045237	SkillPak HIC (TOYOPEARL Phenyl-650M, PPG-600M, Hexyl-650C)	-	1 mL×3種×2支	預裝柱
0045238	SkillPak HIC (TOYOPEARL Phenyl-600M, PPG-600M, Hexyl-650C)	-	1 mL×3種×2支	色譜柱
0045256	SkillPak TOYOPEARL Ether-650M	40 - 90	5 mL×1支	預裝柱
0045254	SkillPak TOYOPEARL PPG-600M	40 - 90	5 mL×1支	預裝柱
0045253	SkillPak TOYOPEARL Phenyl-650M	40 - 90	5 mL×1支	預裝柱
0045252	SkillPak TOYOPEARL Phenyl-600M	40 - 90	5 mL×1支	預裝柱
0045251	SkillPak TOYOPEARL Butyl-650M	40 - 90	5 mL×1支	預裝柱
0045250	SkillPak TOYOPEARL Butyl-600M	40 - 90	5 mL×1支	預裝柱
0045255	SkillPak TOYOPEARL Hexyl-650C	50 - 150	5 mL×1支	預裝柱

*不同級別的填料中，有不同粒徑和不同包裝規格的產品。

SkillPak分為1 mL色譜柱（7 mm I.D.×2.5 cm）和5 mL色譜柱（8 mm I.D.×10 cm）。

1 mL型號：進口：使用“貨號0017955 拉緊螺栓型（帶堵頭）”，不可使用“貨號0016566 便攜式接頭·1/16"（PEEK）”。出口：可直接連接內螺紋接頭，連接外螺紋接頭時需使用管套（“貨號0017898 拉緊螺栓型管套”）等配件。

5 mL型號：進口和出口：使用“貨號0016566 便攜式接頭·1/16"”或“貨號0017955 拉緊螺栓型（帶包頭）”。

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