隨著技術(shù)的，內(nèi)毒素檢測方法也從初的兔熱原檢測法（RPT）發(fā)展到鱟試劑檢測法(LAL/TAL)，再到如今的重組因子C(rFc)法，經(jīng)歷了從體內(nèi)到體外，從少量到通量，從緩慢到快速的逐步發(fā)展更替，來不斷滿足行業(yè)發(fā)展的需求。

圖1內(nèi)毒素檢測方法發(fā)展史

近年來，重組C因子內(nèi)毒素檢測法以其快速、簡單、非動物源等特點受到越來越多的關(guān)注，有望替代鱟試劑，成為內(nèi)毒素檢測的主要方法。我們將從4個方面論述了這一替代趨勢的必然性：

• 從原理角度看，LAL和rFC都能用于內(nèi)毒素檢測

• 重組生物技術(shù)的發(fā)展必然帶來檢測方法的革新

• 對rFc檢測法在應(yīng)用中所面臨的阻力的深度理解

• 對rFC法接受度的逐步增長及法規(guī)和監(jiān)管狀態(tài)加持

圖2rFC重組因子檢測法應(yīng)用的四大支柱

1）LAL既定效用；2）重組技術(shù)的發(fā)展；3）對面臨阻力的深度理解；4）接受度的逐步增長

從工作原理上看，LAL和rFC都能用于內(nèi)毒素檢測

從原理上看，rFC方法的發(fā)明是基于對鱟試劑法內(nèi)毒素檢測的級聯(lián)反應(yīng)的通路理解。生物化學(xué)家表征了鱟凝血級聯(lián)中的蛋白質(zhì)成分，系其血細胞和變形細胞中的一系列絲氨酸蛋白酶（C因子、B因子、G因子和凝固酶原、凝固蛋白原）[1-2]，這些絲氨酸蛋白酶負責(zé)在內(nèi)毒素存在時的鱟血液凝固（圖3），為行業(yè)內(nèi)從凝膠法檢測發(fā)展到動態(tài)濁度法、動態(tài)顯色法，之后發(fā)展到rFC方法提供了科學(xué)依據(jù)。同時，標準品CSE/RSE和標準的建立也為包括rFC方法的定量檢測打好了良好基礎(chǔ)。

圖3鱟試劑內(nèi)毒素檢測原理

重組生物技術(shù)的發(fā)展必然帶來檢測方法的革新

自1982年，禮來公司生產(chǎn)出了個商業(yè)化重組人胰島素Humulin®以來，越來越多的治療性大分子被開發(fā)，也給生物技術(shù)行業(yè)帶來了一股新的力量。多年來，科學(xué)家一直在試圖生產(chǎn)出一種可持續(xù)、環(huán)保、經(jīng)濟的人工合成內(nèi)毒素識別因子,保護鱟資源。

隨著對凝血級聯(lián)酶的認知不斷積累，科學(xué)家們對內(nèi)毒素敏感的絲氨酸蛋白酶因子C進行了基因工程改造。從開始了解C因子的生化性質(zhì)，到使用分子生物學(xué)技術(shù)進行克隆，并在各種宿主（細菌、酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞）中表達全功能重組因子C蛋白，歷經(jīng)了15年[3-5]，終確定重組C因子(rFC)的多功能結(jié)構(gòu)域，使其成為一種具有酶活性的前體，識別和結(jié)合內(nèi)毒素后表現(xiàn)出催化活性。

rFc法只需一步即可酶切熒光底物產(chǎn)生熒光，并根據(jù)底物酶切的量來反饋內(nèi)毒素含量，符合實驗動物的3R原則：減少，替換，優(yōu)化，以及第四個“R”原則，即內(nèi)毒素檢測的重現(xiàn)性。因此，采用rFC代替LAL的優(yōu)勢是顯而易見的。

對rFC檢測法在應(yīng)用中所面臨阻力的深度理解

圖4內(nèi)毒素檢測方法及原理 rFC是單組分，單步驟敏感特異的內(nèi)毒素檢測方法

在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，藥品和診斷產(chǎn)品受到高度監(jiān)管，采用可靠的LAL內(nèi)毒素檢測替代方法，例如rFc方法，對水、原材料和過程樣品的測試都非常重要，因為替代方法的使用可以大約節(jié)約90%的鱟試劑使用。近半個世紀以來，盡管LAL檢測也存在一些問題，制藥公司和醫(yī)療保健行業(yè)仍在很大程度上依賴于LAL，直到2004年，rFC方法才商業(yè)化。

但是，從RPT到LAL，從LAL到rFC，內(nèi)毒素檢測方法的更替都是基于行業(yè)發(fā)展的需求，縱觀歷史，都需要一定的時間，需要行業(yè)的反復(fù)論證和實踐檢驗。

迄今為止，rFC檢測方法認可度也算是在逐漸提高，也是一種久經(jīng)考驗的LAL檢測補充或替代方法。不僅僅具有“3S”優(yōu)勢Scientific characterization（可靠）、Sensitivity（靈敏）和Specificity（特異），還具有易于被大規(guī)模、批量、自動化生產(chǎn)，批間一致性有保障，不受G因子旁路干擾等特點，更有利于制藥公司獲得、可靠檢測結(jié)果。

rFC的未來之路——法規(guī)和監(jiān)管狀態(tài)（美國、歐盟、中國）

多年來，科學(xué)家們一直設(shè)想將鱟的先天免疫研究結(jié)果應(yīng)用于生物技術(shù)、制藥和人類保健行業(yè)。C因子和許多其他進化保守的分子已被確定為在免疫防御、抗菌作用和治療敗血癥方面具有實用性，LAL也應(yīng)該重點用于拯救生命和提高生活質(zhì)量的分子研究[6-7]。基于rFC的內(nèi)毒素檢測的應(yīng)用已得到研究應(yīng)用的支持，緩解了潔凈技術(shù)中對鱟的需求。禮來公司采用rFC 進行藥物質(zhì)量控制，其中四個已成功獲得FDA的認可，證明了rFC用于注射藥物安全性檢測的可靠性和價值[8-9]。

從資源可及性角度看，鱟的持續(xù)捕撈也非常不明智，它會給整個醫(yī)藥產(chǎn)品供應(yīng)鏈帶來風(fēng)險。很多科學(xué)家也在努力促進使用合成rFC代替LAL，以保護鱟免于滅絕，加速了rFC作為藥典試驗的采用。隨著制藥行業(yè)發(fā)展，越來越多法規(guī)許可rFC作為LAL方法的替代方法（表1）。目前有超過100家生產(chǎn)公司在使用rFC方法用于質(zhì)控，以實現(xiàn)高效的過程生產(chǎn)和質(zhì)量。

 

Lonza是被授權(quán)生產(chǎn)rFC因子的廠商，其中PyroGene重組因子試劑盒已被多家藥企使用。一項 多中心研究顯示，使用PyroGene從水和其它測試產(chǎn)品中回收內(nèi)毒素與基于LAL的方法相當。試劑盒驗證的結(jié)果發(fā)表在藥典論壇36[1]卷（2010年1月-2月）。

自1970年至今半個世紀以來，Lonza作為較早期開發(fā)內(nèi)毒素檢測產(chǎn)品的公司，為客戶提供包括細菌內(nèi)毒素檢測試劑盒、內(nèi)毒素檢測軟件、內(nèi)毒素檢測酶標儀在內(nèi)的一站式解決方案，符合FDA21CFR part 11和歐盟EUGMP附錄11法規(guī)要求，已用于國外藥物的放行，滿足出口型/雙報制藥企業(yè)的規(guī)模化內(nèi)毒素測定需求。