引言

腫瘤發(fā)病率和死亡率持續(xù)增高造成了嚴(yán)重的社會(huì)負(fù)擔(dān)，驅(qū)動(dòng)著腫瘤治療的重要手段之一的CAR-T，TCR-T等細(xì)胞治療技術(shù)的發(fā)展。
細(xì)胞治療是利用來(lái)自患者或供體的活細(xì)胞來(lái)代替受損或患病的細(xì)胞，或刺激身體的免疫反應(yīng)或再生的治療，通常使用的是干細(xì)胞與免疫細(xì)胞。
本期將分別從基因、蛋白、細(xì)胞、組織四個(gè)層面展開，對(duì)細(xì)胞治療領(lǐng)域前沿技術(shù)與文獻(xiàn)進(jìn)行解析和分享。

#1 基因?qū)用?/span>

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在細(xì)胞治療中的應(yīng)用
01 干細(xì)胞治療
通過干細(xì)胞分離、體外培養(yǎng)、定向誘導(dǎo)、甚至基因修飾等過程，在體外繁育出全新的、正常的甚至更年輕的細(xì)胞、組織或器官，并最終通過細(xì)胞組織或器官的一致實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床疾病的治療。
干細(xì)胞種類多，按發(fā)育潛能和階段可以分為不同類型。不同條件會(huì)誘導(dǎo)出不同類型、不同干性的干細(xì)胞；通過單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，分析細(xì)胞轉(zhuǎn)錄及蛋白特征，可以準(zhǔn)確了解干細(xì)胞的表型，也可聯(lián)合臨床結(jié)果做關(guān)聯(lián)性分析。

· 樣本類型：健康人&AML（急性髓系白血病）患者骨髓
· 前期準(zhǔn)備：流式富集，將CD34陽(yáng)性造血干細(xì)胞、CD34陰性細(xì)胞、CD3陽(yáng)性T細(xì)胞混樣測(cè)序
· 細(xì)胞分型：通過轉(zhuǎn)錄組+蛋白組學(xué)的研究，將骨髓內(nèi)的干細(xì)胞分為了56個(gè)亞群

·Focus在CD34陽(yáng)性的造血干細(xì)胞
進(jìn)行以下分析：

1. 擬時(shí)序分析HSC發(fā)育狀態(tài)。

2.通過Abseq定義新的HSC發(fā)育Marker。

3.通過對(duì)HSC的Abseq結(jié)果進(jìn)行算法分析，最終用12個(gè)Marker高精確度地鑒定14個(gè)CD34陽(yáng)性亞群。

單細(xì)胞測(cè)序的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)在于，通量更高，可達(dá)上萬(wàn)個(gè)基因的維度分析。

02 CAR-T細(xì)胞治療
 CAR-T細(xì)胞治療工作流程

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)應(yīng)用節(jié)點(diǎn)：
研發(fā)質(zhì)控階段——分析T細(xì)胞發(fā)生了哪些變化，細(xì)胞狀態(tài)、克隆型、生物學(xué)特征、臨床關(guān)聯(lián)等。

（1）在CAR-T治療臨床前應(yīng)用

（2）在CAR-T臨床研究中的應(yīng)用

單細(xì)胞測(cè)序優(yōu)勢(shì)：
在傳統(tǒng)技術(shù)上進(jìn)行更加透徹的分析：大細(xì)胞通量的條件下，進(jìn)行全基因組+蛋白組，高緯度地分析每一個(gè)單細(xì)胞特征，包括：基因表達(dá)、富集功能、特異性Marker、聚類分群、異質(zhì)性等。

03 TIL、TCR治療
（1）TIL治療機(jī)制研究

通過單細(xì)胞RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合過繼性療法IL8R1+cluster細(xì)胞比例更高：IL8R1+cluster中高表達(dá)IL7R。

（2）腫瘤特異性TCR研究

（間接研究antigen-TCR）

發(fā)現(xiàn)黑色素瘤抗原特異性CD4+T亞群，并研究其phenotype及功能。

（直接研究antigen-TCR）
抗原特異性CD8+T細(xì)胞表型分析
CD8+T細(xì)胞：抗原-TCR paire分析

全基因組光學(xué)圖譜技術(shù)（OMG）在細(xì)胞治療中的應(yīng)用
01 文獻(xiàn)解析
AML和MDS患者中，DEK-NUP214融合是重現(xiàn)性的異常，預(yù)后不良。該融合在髓系血液腫瘤中比例較低（~0.7-2%）.傳統(tǒng)核型G顯帶不容易檢出t(6;9),尤其是低分辨率的骨髓染色體。加拿大大學(xué)健康醫(yī)學(xué)聯(lián)盟在今年2月報(bào)道了AML患者中t(6;14;9)三重易位，據(jù)了解，這是first通過細(xì)胞遺傳學(xué)檢出的AML患者中t(6;14;9)三重易位。

t(6;9)的其他易位形式報(bào)道案例較少，2例涉及DEK-NUP214融合事件被報(bào)道。一例是核型檢出t（1;9）, 轉(zhuǎn)錄組檢出DEK-NUP214融合。另一例是細(xì)胞遺傳學(xué)檢出t(9;12)(q34;q15)且隱匿性插入在6號(hào)染色體上，也是通過RNA seq檢出DEK-NUP214融合。由于6p和9q遠(yuǎn)端片段交換或隱匿性插入較難觀察到，導(dǎo)致難以確定是否存在DEK-NUP214融合。將高分辨率SV檢測(cè)技術(shù)OGM納入常規(guī)臨床檢測(cè)有助于檢出罕見的隱匿性的細(xì)胞遺傳學(xué)異常。

該患者為一位32歲男性，圖（A）核型G顯帶初始檢測(cè)結(jié)果為18個(gè)細(xì)胞add(6)(p21),add(9)(q34),add(14)(q22)，2個(gè)細(xì)胞核型正常。基于核型結(jié)果6號(hào)和9號(hào)染色體易位斷裂點(diǎn)位于DEK和NUP214基因所在的區(qū)帶，序貫進(jìn)行DEK和NUP214的FISH探針檢測(cè)，圖（B）顯示在衍生6號(hào)染色體上觀察到DEK和NUP214融合信號(hào)，隨后依據(jù)FISH驗(yàn)證結(jié)果將核型結(jié)果修正為t(6;14;9)(p22;q22;q34).

隨后進(jìn)行了OGM檢測(cè)，circos plot圈圖（C）顯示斷裂點(diǎn)該患者樣本檢出位于6p22.3,9q34.12,14q22.1的三重易位，且線形圖（D）顯示DEK-NUP214融合基因。DEK-NUP214融合基因預(yù)后不良，該患者經(jīng)誘導(dǎo)治療，鞏固治療后接受了同種異基因造血干細(xì)胞移植。

OGM可一次實(shí)驗(yàn)檢出和明確涉及DEK-NUP214融合的t(6;14;9)三重易位，該團(tuán)隊(duì)建議將OGM納入臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)流程，用于檢出白血病中與預(yù)后和治療相關(guān)的異常。

  · Bionano Saphyr系統(tǒng)以100kbp-Mbp級(jí)別讀長(zhǎng)可實(shí)現(xiàn)超高靈敏度的結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)分析和復(fù)雜基因組de novo組裝。

在結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)領(lǐng)域目前廣泛應(yīng)用于腫瘤、白血病、遺傳病、罕見病等疾病的研究。相比傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)工具，如核型、FISH，Saphyr 擁有優(yōu)秀的分辨率、全基因組覆蓋度，便捷的操作流程以及直觀的結(jié)果呈現(xiàn)，對(duì)結(jié)構(gòu)變異領(lǐng)域的難點(diǎn)平衡易位和倒位，可準(zhǔn)確檢出。在基因組de novo組裝領(lǐng)域，Saphyr 幫助生物學(xué)家極大提高scaffold，提升組裝質(zhì)量和完整性。

Saphyr 半導(dǎo)體芯片上有多達(dá)120,000個(gè)納米通道，經(jīng)高清CCD對(duì)所有納米通道的DNA實(shí)時(shí)成像，每個(gè)flowcell可采集高達(dá)5T數(shù)據(jù)，軟件自動(dòng)將圖片數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成分子數(shù)據(jù)，最終組裝得到全基因組光學(xué)圖譜。

#2 蛋白層面

MSD第三代電化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)在細(xì)胞治療中的應(yīng)用
01 應(yīng)用總覽

  · 在接受CAR-T細(xì)胞治療前，評(píng)估病人免疫狀況，（Cytokinesis，CRP，Inflammation）。
  · 評(píng)估細(xì)胞因子狀況，是否被激活，有效性（IFN-γ）。
  · 監(jiān)測(cè)免疫系統(tǒng)的狀態(tài)
  · 監(jiān)控免疫進(jìn)程，免疫有效性，副反應(yīng)發(fā)生，評(píng)估免疫原性，毒性。

免疫治療相關(guān)熱門靶點(diǎn)：CTLA-4,Granzyme A,Granzyme B,LAG3,vWF，PD1，PDL-2，推薦使用MSD R-plex試劑盒進(jìn)行開發(fā)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，目前可以提供超過260種抗體對(duì)可供選擇，應(yīng)用涵蓋：癌癥、免疫、心血管、神經(jīng)、代謝、疫苗等。
     
02 應(yīng)用案例
(1)同濟(jì)醫(yī)院采用MSD進(jìn)行CAR-T細(xì)胞治療臨床效果的關(guān)聯(lián)性分析

IL-8，IL1β，IFN-γ升高，代表患者感染，需采取不同的治療方案

結(jié)論：使用CAR-T細(xì)胞治療后，若患者發(fā)熱，則可通過分析以上因子的分泌情況，區(qū)分患者感染與CRS

（2）Kite 制藥，使用MSD監(jiān)測(cè)CRS

發(fā)現(xiàn)使用MSD技術(shù)相較于Luminex更加簡(jiǎn)便，且有嚴(yán)格的Validation。

（3）紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心

（4）eurofins歐陸集團(tuán)

(5)中檢院
《CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)控研究要點(diǎn)》建議采用MSD方法進(jìn)行藥效學(xué)檢測(cè)、免疫毒性檢測(cè)。

（6）諾華制藥：
上市的細(xì)胞治療藥物免疫原性評(píng)價(jià)時(shí)，使用MSD進(jìn)行檢測(cè)
 
（7）Juno在細(xì)胞治療研發(fā)階段使用到MSD
采用基因編輯的方法，敲除PD1，進(jìn)行免疫水平評(píng)估，探究是否能夠提高CAR-T細(xì)胞治療效果。結(jié)果表明：CAR-T細(xì)胞免疫原性明顯增強(qiáng)。
 
  (8)使用CAR-T成功治愈患者的學(xué)者Carl H.June，以及腫瘤免疫治療先*Steven A Rosenberg也采用MSD方法進(jìn)行細(xì)胞免疫學(xué)研究。

03 MSD在CRS（細(xì)胞因子風(fēng)暴）監(jiān)測(cè)應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)
 CRS監(jiān)測(cè)需借助靈敏度高、動(dòng)態(tài)范圍廣、有嚴(yán)格法規(guī)驗(yàn)證的平臺(tái)。這凸顯了MSD技術(shù)的極大優(yōu)勢(shì)：

（1）4-5 log超寬檢測(cè)范圍，fg/ml的檢測(cè)極限，多個(gè)產(chǎn)品類型選擇

（2）經(jīng)過嚴(yán)格的Validation的V-plex試劑盒

  · CRS監(jiān)測(cè)應(yīng)用案例
Kite ，NCI，Juno等使用MSD試劑盒監(jiān)測(cè)CAR-T細(xì)胞治療的細(xì)胞因子風(fēng)暴

  · 免疫原性金標(biāo)準(zhǔn)
獲FDA，EMEA等法規(guī)推薦，經(jīng)過大量臨床實(shí)驗(yàn)使用和CRO驗(yàn)證，符合GLP要求。

MSD技術(shù)流程概覽

#3 細(xì)胞層面

Lonza核電轉(zhuǎn)儀在細(xì)胞治療中的應(yīng)用

自體T細(xì)胞免疫療法其中一個(gè)關(guān)鍵痛點(diǎn)是GMP病毒載體（慢病毒和γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒）的安全性、漫長(zhǎng)的生產(chǎn)周期和高額的費(fèi)用。

 解決這個(gè)問題的一個(gè)辦法是利用非病毒轉(zhuǎn)染方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因修飾。該研究和開發(fā)進(jìn)展迅速，但關(guān)鍵瓶頸在于擴(kuò)大制造規(guī)模以滿足商業(yè)需求。

Lonza的4D-Nucleofector™LV 單元采用電穿孔技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、可擴(kuò)展多種細(xì)胞類型和應(yīng)用的非病毒轉(zhuǎn)染方案。

以新鮮/冷凍的PBMC作為起始，4D-Nucleofector ™轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)入平臺(tái)，第10天收獲最終的T細(xì)胞產(chǎn)物。

如圖所示，在電轉(zhuǎn)后：

第0天-完成電轉(zhuǎn)的PBMC靜置4小時(shí)恢復(fù)，用含有IL-2和TransAct的X-VIVO培養(yǎng)基進(jìn)行80%換液。
第1天–進(jìn)行50%的培養(yǎng)基交換（276ml容量）。
第3天–進(jìn)行80%的培養(yǎng)基交換（450ml容量），并移除TransAct。
第4天到第9天-進(jìn)行75%的培養(yǎng)基交換（450ml容量）。
第10天-收集擴(kuò)增的T細(xì)胞。

在第0、1、4、7和10天取樣分析。

#4 組織層面

HALO數(shù)字病理圖像全景分析技術(shù)在細(xì)胞治療中的應(yīng)用

腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的特征及其對(duì)腫瘤治療和預(yù)后的潛在影響是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。在組織空間程度上分辨基因表達(dá)已成為了解組織內(nèi)復(fù)雜多細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵技術(shù)。RNA和蛋白質(zhì)的分析為理解表達(dá)調(diào)控提供了寶貴的信息，能夠在空間的角度對(duì)蛋白質(zhì)和基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析。為了探索組織內(nèi)細(xì)胞復(fù)雜的相互作用，ISH-IHC的相互結(jié)合為在同一組織樣本上觀察多個(gè)RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)提供了可能。

通過策略性地選擇ISH和IHC/IF標(biāo)記，RNAscope可以針對(duì)分泌蛋白(如細(xì)胞因子或趨化因子)的轉(zhuǎn)錄本，而IHC/IF可以針對(duì)細(xì)胞標(biāo)記，以識(shí)別分泌蛋白的細(xì)胞來(lái)源。

免疫細(xì)胞浸潤(rùn)到腫瘤，其激活狀態(tài)和檢查點(diǎn)表達(dá)模式均可通過雙重ISH-IHC/IF法進(jìn)行檢測(cè)，其中ISH檢測(cè)激活標(biāo)志物，IHC/IF法檢測(cè)CD3、CD4、CD8、CD68、CD45等免疫細(xì)胞標(biāo)志物。

此外，用戶還可以根據(jù)IF和探針的陽(yáng)性率來(lái)定義細(xì)胞表型。

KFBIO江豐數(shù)字化病理掃描儀

01 設(shè)備推薦
  · 高通量持續(xù)加載掃描系統(tǒng)KF-PRO-400

  · 明場(chǎng)&熒光一體掃描系統(tǒng)KF-PRO-EX

02 產(chǎn)品特點(diǎn)
  · 高速掃描——線掃描技術(shù)
  · 高速穩(wěn)定運(yùn)動(dòng)——直線磁軸電機(jī)
  · 自適應(yīng)的掃描方式
  · 熒光機(jī)型——KF-FL系列（科研級(jí)SCMOS熒光相機(jī)）
  · 專業(yè)分析軟件