島津中國創(chuàng)新中心與北京陽光諾和藥物研究股份有限公司和中國食品藥品檢驗研究院合作，采用島津二維高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜法（2D-LC-QTOF），對頭孢美唑鈉熱降解的未知雜質(zhì)進(jìn)行了定性鑒定。

背景介紹

β-內(nèi)酰胺類抗生素，主要包括頭孢菌素類、青霉素類和碳青霉烯類。頭孢美唑是第二代半合成的頭孢類抗生素。2020版《中國藥典》，美國藥典（USP43）和日本藥典（JP17）都收錄了注射用頭孢美唑鈉。在注射用頭孢美唑鈉的質(zhì)量研究中，發(fā)現(xiàn)其對熱比較敏感，頭孢美唑內(nèi)酯（cefmetazole lactone）和1-甲基-5-巰基四氮唑（1-methyl-5-mercaptotetrazolium）在高溫條件下均有明顯增加，主峰后出現(xiàn)3個明顯的未知雜質(zhì)。

某仿制藥和參比制劑樣品中實際檢出的未知雜質(zhì)含量超過了ICH Q3B規(guī)定的鑒定閾值（頭孢美唑日用最大劑量為4g，對應(yīng)的雜質(zhì)鑒定閾值為0.10%；部分樣品中如圖1所示雜質(zhì)3的量超過0.10%），故嘗試對注射用頭孢美唑鈉檢出的未知雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。圖1給出了注射用頭孢美唑鈉熱解樣品的一維（圖1A）和3種目標(biāo)雜質(zhì)（雜質(zhì)1-3）的二維（圖1B）紫外色譜圖。

圖1 注射用頭孢美唑鈉熱解樣品的一維(1A)和3種目標(biāo)雜質(zhì)（雜質(zhì)1-3）的二維(1B)色譜圖

解決方案

島津液相系統(tǒng)Nexera LC-40 +高分辨質(zhì)譜儀LCMS-9030

基于二維液相色譜-高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)，采用中心切割技術(shù)將在一維中采用含非揮發(fā)性鹽的流動相中分離得到的目標(biāo)未知物導(dǎo)入二維色譜，在二維色譜中采用質(zhì)譜兼容的揮發(fā)性流動相，進(jìn)而采用高分辨質(zhì)譜對未知物進(jìn)行定性鑒定。一維色譜采用《中國藥典》中注射用頭孢美唑鈉的有關(guān)物質(zhì)檢查方法，流動相中含不揮發(fā)的磷酸鹽和離子對試劑（四丁基氫氧化銨，TBAH）。二維色譜采用C18色譜柱，利用磷酸鹽在色譜柱上不保留，TBAH在高比例水相下不易洗脫等性質(zhì)，通過閥切換技術(shù)和改變流動向比例等方法洗脫導(dǎo)入廢液，避免質(zhì)譜污染。

表1 頭孢美唑鈉中雜質(zhì)的分子式、加和離子和誤差

在結(jié)構(gòu)解析中，通過比較頭孢美唑鈉和未知降解雜質(zhì)的母離子及特征碎片離子的相關(guān)性，結(jié)合文獻(xiàn)報道的頭孢類抗生素及雜質(zhì)的裂解規(guī)律，對頭孢美唑鈉中的三種未知雜質(zhì)進(jìn)行科學(xué)合理的定性分析。表1列出了三種未知雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和誤差。以雜質(zhì)2為例，在正模式下的一級質(zhì)譜圖（見圖2A）：主要離子為m/z 488.0320，m/z 372.0160，m/z 505.0586。m/z 488.0320與m/z 505.0586相差17，可推斷m/z 505.0586為m/z 488.0320的[M+NH4]+峰。m/z 488.0320的二級產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖（見圖2B）。推測雜質(zhì)2的結(jié)構(gòu)和裂解規(guī)律（見圖3），雜質(zhì)2可能為7-甲巰基頭孢美唑。同時，7-甲巰基頭孢美唑也是一種常見的頭孢美唑雜質(zhì)。

圖2 雜質(zhì)2在正模式下的掃描離子(2A)和m/z 488.0320的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖(2B)

圖3 雜質(zhì)2可能的結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜裂解規(guī)律

結(jié)論

本研究對頭孢美唑中的3種未知雜質(zhì)進(jìn)行了科學(xué)合理的定性分析，對于頭孢美唑的質(zhì)量控制及安全性評價具有重要意義。本分析方法適用于β-內(nèi)酰胺類抗生素中未知雜質(zhì)的分離和定性，具有很強的通用性，同時可對化學(xué)藥物、天然產(chǎn)物、多組分生化藥等復(fù)雜組成體系進(jìn)行定性鑒別，從而提供可靠的質(zhì)量控制分析方法。

本工作基于創(chuàng)新中心搭建的專屬性中心切割二維反相色質(zhì)譜聯(lián)用分析平臺（2D-LC-QTOF）和開發(fā)的《抗生素雜質(zhì)數(shù)字化標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫》，該數(shù)據(jù)庫收錄了β-內(nèi)酰胺類抗生素的一般雜質(zhì)和聚合物雜質(zhì)的色譜和高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，還登錄了抗生素相關(guān)雜質(zhì)的液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜分析方法。該分析平臺不僅為企業(yè)客戶大大降低了企業(yè)研發(fā)成本，同時也為企業(yè)的工藝改進(jìn)、劑型研發(fā)、品質(zhì)提升等方面提供技術(shù)參考。

參考文獻(xiàn)：

《采用二維高效色譜-串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜法對注射用頭孢美唑鈉的未知雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析》《中國藥學(xué)雜志》中圖分類號：R917 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A  文章編號：1001-2494(2022) 08-0645-06 doi: 10.11669/cpj.2022.08.009