簡介

成型的腫瘤是一個復雜的組織，它不僅由腫瘤細胞組成，還包括也基質細胞，炎癥細胞，脈管系統和細胞外基質（ECM），所有這些總和定義為腫瘤微環境（TME），并且在腫瘤惡性進展、免疫逃逸和治療抵抗中發揮重要作用^[1]。針對腫瘤微環境的特點開發安全有效的腫瘤免疫療法是當前腫瘤治療領域中*前景的熱點之一^[2]。至今， 已有多項批準藥物用于不同類型腫瘤的治療，在腫瘤治療方面取得了令人矚目的成就^{[2, 3]}。然而，腫瘤細胞也能夠通過多種途徑負向調節機體免疫應答，從而逃逸機體的免疫監管。因此，免疫治療仍存在巨大的挑戰，比如治療效果和患者反應的不可預估性，腫瘤免疫治療抵抗性，以及有效生物標志物缺乏等等^[4]

免疫治療的陽性反應通常依賴于腫瘤細胞與腫瘤微環境（TME）內免疫調節的相互作用。在這些相互作用下，腫瘤微環境在抑制或增強免疫應答中發揮著重要的作用。認識免疫治療與TME間的相互作用不僅是剖析作用機制的關鍵，為改善目前免疫治療的療效提供新的方法也具有十分重要的意義^[5]。

多重免疫組化技術在評估腫瘤微環境中各細胞組分的表達豐度，相互作用以及空間表型信息有*的優勢。可在同一張切片上同時對多個靶點進行標記，幫助研究者定量評估細胞的表型和活性，全景刻畫腫瘤免疫微環境以及細胞間的原位空間信息，能讓我們更深入地了解腫瘤的發生機制，更有可能預測腫瘤對治療的反應^[6-9]。本方案中， 我們使用了TissueGnostics公司TissueFAXS Cytometry全景組織流式定量分析技術結合Absin七色多重熒光免疫組化染色試劑盒(abs50015)，在扁桃體腫瘤樣本中開展的多色免疫組化應用探索。 

Panel及染料信息

*Panel及染料信息（對樣本中腫瘤細胞及不同免疫細胞表型進行多色標記）

在石蠟包埋的甲狀腺癌組織切片上對切片進行TSA酪胺 信號方法技術，采用HRP標記的二抗，HRP催化加入體 系的熒光素底物，生成活化熒光底物，活化底物可與抗原上的Tyrosine共價結合，使樣品上穩定地共價結合熒光素。之后用熱修復洗去非共價結合的抗體，避免交叉反應，如此往復實現多重熒光標記。

使用Absin七色多重熒光免疫組化染色試劑盒的全新一代T S A 染色技術同時標記 6 種生物標志物后， 使用TissueFAXS Spectra系統進行連續全光譜高倍率成像， 構建全景（多光譜）虛擬切片。獲得清晰的多色樣本圖像及各單通道獨立信號，從多靶點角度描繪復雜的腫瘤免疫微環境。

多色免疫熒光圖像獲取及光譜拆分

圖 1. 人甲狀腺癌組織的多重IHC 染色光譜拆分。去除背景自發熒光或血細胞/膠原等自發熒光以及去除粘液團非特異性染色的各抗體獨立真實染色圖像。使用人甲狀腺癌FFPE的七色多光譜圖像及光譜拆分結果。

組織原位蛋白細胞亞群分析

TG的細胞核識別算法在組織原位提供精準的單細胞識別基礎，大數據的可視化正反向回溯校驗技術為其精準性提供了進一步的保障。TG組織原位流式分析功能對目標細胞進行層層篩選，可獲得雙標、三標乃至更 多標的細胞的定量表達及空間定位信息，可個性化分析組織切片中任意細胞的表型特征，為細胞亞群原位可視化精準分型提供強大的支撐。
圖2.利用Absin七色多重熒光免疫組化技術多色標記及TissueFAXS Cytometry 技術對樣本進行免疫細胞分型篩選及單靶點定量。圖中展示的是通過的組織流式散點圖對CD20+CD4-CD3-細胞的層層篩選識別（左圖綠色圈出），散點圖可追溯到圖像 的每一個單細胞。首先是CD20+陽性細胞群（右上圖）對此細胞群設立Cutoff線，篩選陽性細胞。并引用該陽性細胞群到下一散點圖，篩選CD4與CD3陰性細胞群（右下圖）。

圖 3.可視化正反向回溯校驗示意圖。點擊圖像中識別到的每一個指標都可在右側散點圖中一一對應，同時散點圖中的每個點都可精準追溯到圖像中，便于我們觀察。

空間多維度定量解析腫瘤微環境

利用TissueFAXS Cytometry技術實現從單細胞、細胞群、組織結構乃至器官級別的多模態，跨尺度的空間關系量化分析研究。比如可在研究腫瘤微環境方向通過空間數據挖掘延伸至腫瘤亞微環境，進一步細化對腫瘤亞微環境中多種標記細胞與單細胞或細胞群體之間、單細胞與腫瘤組織之間、特定細胞群體與腫瘤組織之間，腫瘤組織與血管之間等復雜的相互作用關系、進而衍生出更為豐富社會學關系，挖掘以細胞社區為功能單位的科學信息，為解釋疾病的發生發展提供重要的數據來源。

圖4.以腫瘤為中心細胞群體空間分布圖。利用TissueFAXS Cytometry 技術中人工智能Classifier功能對組織樣本腫瘤與間質區域進行特異性識別，并以腫瘤區域為中心，微米級別精度對微環境中免疫細胞的空間分布進行單細胞量化分析，不同顏色代表距離腫瘤的不同距離范圍。右側散點圖中不同顏色點數表示距離腫瘤不同距離的免疫細胞浸潤數量。

圖5.腫瘤細胞（綠色）與NK細胞（黃色）的相互作用細胞社會關系分析示意圖。通過TissueFAXS Cytometry 技術分析腫瘤細胞與NK細胞的距離關系，統計腫瘤細胞周圍30范圍內的NK細胞，并以連線示意。

TissueFAXS Cytometry全景組織流式定量分析平臺

基于組織原位的精準單細胞定量，強大的人工智能（AI）的特征性組織識別以及像素級的精細空間量化分析等強大的運算處理功能自由交互聯用，提供從染色到成像到數據挖掘的一站式解決方案，并可在腫瘤免疫學，神經生物學等不同的復雜微環境中實現精準的定制化分析。

圖 6.TissueFAXS Cytometry 工作流程示意圖。

References:

1.Balkwill, F.R., M. Capasso, and T. Hagemann, The tumor microenvironment at a glance. J Cell Sci, 2012. 125(Pt 23): p. 5591-6.
2.Bejarano, L., M.J.C. Jordao, and J.A. Joyce, Therapeutic Targeting of the Tumor Microenvironment. Cancer Discov, 2021. 11(4): p. 933-959.
3.Galon, J. and D. Bruni, Approaches to treat immune hot, altered and cold tumours with combination immunotherapies. Nat Rev Drug Discov, 2019. 18(3): p. 197-218.
4. Hegde, P.S. and D.S. Chen, Top 10 Challenges in Cancer Immunotherapy. Immunity, 2020. 52(1): p. 17-35.
5.Tang, H., J. Qiao, and Y.X. Fu, Immunotherapy and tumor microenvironment. Cancer Lett, 2016. 370(1): p. 85-90.
6.Tsujikawa, T., et al., Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Rep, 2017. 19(1): p. 203-217.
7.Chen, S., et al., Multiomic Analysis Reveals Comprehensive Tumor Heterogeneity and Distinct Immune Subtypes in Multifocal Intrahepatic Cholangiocarcinoma. Clin Cancer Res, 2022. 28(9): p. 1896-1910.
8.Chen, X., et al., CD8(+) T effector and immune checkpoint signatures predict prognosis and responsiveness to immunotherapy in bladder cancer. Oncogene, 2021. 40(43): p. 6223-6234.
9.Wang, T., et al., Spatial distribution and functional analysis define the action pathway of Tim-3/Tim-3 ligands in tumor development. Mol Ther, 2022. 30(3): p. 1135-1148.

愛必信（absin）提供優質多重應該免疫組化試劑盒

Absin多重熒光免疫組化試劑盒能夠實現單片多標，無論是看腫瘤微環境還是看免疫浸潤，無論是進行細胞計數還是共定位分析，我們都可以實現，目前最高可做到六指標七色哦~