培養(yǎng)細(xì)胞需注意哪些小細(xì)節(jié)?

　　培養(yǎng)細(xì)胞就像養(yǎng)育孩子一樣，要精心照料，用心呵護(hù)。每天都去看看它們，滿足它們所需要的物質(zhì)需求，防止出現(xiàn)培養(yǎng)箱缺水、二氧化碳不足、溫度不夠等各種小意外，還要注意很多小細(xì)節(jié)，以免開展重復(fù)的實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致不必要的人力物力浪費(fèi)。

　　那培養(yǎng)細(xì)胞都要注意哪些小細(xì)節(jié)呢?就讓我們一起來看看吧!

　　1.細(xì)胞生長的營養(yǎng)來源

　　不同的細(xì)胞的培養(yǎng)基是不相同的，對(duì)于大多數(shù)腫瘤細(xì)胞來說，營養(yǎng)配方一般為：90%合成培養(yǎng)基(DMEM、RPMI1640、MEM等)和10%胎牛血清(FBS);為了防止污染，可以適時(shí)加1%雙抗，抗生素的使用應(yīng)為短期。

　　Q：細(xì)胞培養(yǎng)基配方如何選擇?

　　A:
一般購買細(xì)胞時(shí)，針對(duì)不同的細(xì)胞株，會(huì)有詳細(xì)的介紹，包括生長的狀態(tài)圖、培養(yǎng)基的類型等。如人源肺癌細(xì)胞A549可用DMEM培養(yǎng)基，在胎牛血清的選擇上也可以選用來源可靠的胎牛血清，能提供較好的營養(yǎng)成分，以滿足細(xì)胞株生長的需要。

　　Q：如果細(xì)胞生長緩慢，需要增加血清比例嗎?

　　A：可以。

　　2.細(xì)胞生長的環(huán)境

　　舒適無菌的環(huán)境是細(xì)胞健康生活的重要基礎(chǔ)。需要合適的器皿，不同形狀、規(guī)格、用途多樣的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板等，最終進(jìn)入合適的恒溫箱培養(yǎng)，如腫瘤細(xì)胞就需37℃，5%CO2的恒溫箱中生長。

　　Q：細(xì)胞培養(yǎng)板及培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶如何選擇?

　　A：根據(jù)不同的應(yīng)用選擇不同的培養(yǎng)皿或容量板，如MTS用96孔板，細(xì)胞爬片用24孔，流式分析用6空等

　　而選擇培養(yǎng)皿還是選擇培養(yǎng)瓶，就細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)來說差別不大，主要是培養(yǎng)瓶的安全系數(shù)更高一些，數(shù)量也會(huì)大一些，但是成本也相對(duì)較高，因此沒有特殊要求時(shí)，一般用培養(yǎng)皿即可。

　　Q：血清是否要滅活處理，保證環(huán)境無菌?

　　A：這取決于您的應(yīng)用。

　　滅活過程中，會(huì)導(dǎo)致血清中某些成分被破壞，如氨基酸，維生素，生長因子等。所以只有在您的實(shí)驗(yàn)對(duì)血清有特殊要求時(shí)，才會(huì)考慮對(duì)血清進(jìn)行滅活處理。如您的實(shí)驗(yàn)對(duì)血清中的某種組分敏感，需要去除該組分。最常見的情況是需要去除血清中的補(bǔ)體蛋白，因?yàn)檠a(bǔ)體在機(jī)體中參與細(xì)胞殺傷，巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞活化，肥大細(xì)胞和血小板組胺釋放，平滑肌收縮等過程，所以一般在免疫學(xué)相關(guān)研究中及肌細(xì)胞和干細(xì)胞的培養(yǎng)過程中需要對(duì)血清進(jìn)行滅活處理。

　　3.細(xì)胞復(fù)蘇與凍存

　　細(xì)胞復(fù)蘇是指將凍存的細(xì)胞解凍之后再重新培養(yǎng)，細(xì)胞從冷凍停止生長狀態(tài)恢復(fù)生長的過程。

　　Q：細(xì)胞復(fù)蘇后，為什么很多難以貼壁?

　　A：忽略培養(yǎng)基的問題，主要考慮細(xì)胞凍存時(shí)狀態(tài)差或者復(fù)蘇時(shí)動(dòng)作太慢導(dǎo)致細(xì)胞死亡。切記最重要的融化速度要快，可不時(shí)搖動(dòng)冷凍管，使之盡快通過最易受損的溫度段(-5～0℃)。

　　細(xì)胞凍存則是將細(xì)胞放在低溫(-70℃~196℃)環(huán)境，降低細(xì)胞內(nèi)的代謝活動(dòng)，最/大限度的保存細(xì)胞活力，以便長期存儲(chǔ)。

　　Q：目前細(xì)胞凍存液多采用的什么配方?

　　A：目前細(xì)胞凍存多采用DMSO二甲基亞砜或甘油作保護(hù)劑，細(xì)胞凍存液的配方有很多種，如培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高濃度血清有助于維護(hù)細(xì)胞活力，復(fù)蘇存活率在80%～90%以上。

　　4.細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

　　細(xì)胞在培養(yǎng)過程中不斷增殖，培養(yǎng)皿空間有限，細(xì)胞過密生長就會(huì)受到抑制，影響細(xì)胞的狀態(tài)，因此我們要把細(xì)胞中的一部分分到別的培養(yǎng)皿里，這樣細(xì)胞才能生長的好。

　　Q：細(xì)胞傳代培養(yǎng)為什么要選擇對(duì)數(shù)期細(xì)胞?

　　A:
細(xì)胞的生長和分裂，一般遵循以下模式：停滯期，對(duì)數(shù)期(指數(shù)期)，平穩(wěn)期(平臺(tái)期)和衰退期。為了確保活力，遺傳穩(wěn)定性和表型穩(wěn)定，必須使細(xì)胞保持在對(duì)數(shù)期。一般細(xì)胞長到70%~80%左右就可以傳代了。

　　除了上述幾個(gè)環(huán)節(jié)的關(guān)節(jié)問題外，細(xì)胞培養(yǎng)還有很多小問題如下：

　　Q：培養(yǎng)基多久換一次?

　　A:
正常情況下，培養(yǎng)液偏紅色。如果細(xì)胞維持在pH6.5～6.6條件下，培養(yǎng)基變黃，說明培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物已堆積到一定量，細(xì)胞會(huì)脫落死亡，需要更換新鮮培養(yǎng)液。一般細(xì)胞生長旺盛時(shí)1～2天換一次，生長緩慢時(shí)，3～4天亦可。針對(duì)復(fù)蘇后的細(xì)胞，建議隔天換液。

　　Q：血清應(yīng)如何融解?

　　A：從冰箱中取出血清，放于2-8℃融化，融化過程中不時(shí)旋轉(zhuǎn)(swirling mix)混勻。充分融解后分裝或平衡到室溫后使用。

　　Q：如果細(xì)胞形態(tài)不清晰或有異物等，如何處理?

　　A：可以考慮如下操作：首先，倒掉舊的培養(yǎng)基，用新的培養(yǎng)基或者PBS洗滌2-3次，再開始正式的消化、吹打。其次，把吹打下來的細(xì)胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。后續(xù)再密切觀察。

　　Q：血清中出現(xiàn)絮狀沉淀是否需要去除?如何去除?

　　A：多種原因可能導(dǎo)致絮狀沉淀的形成，最常見的原因之一是融化過程中，脂蛋白聚集所致。該現(xiàn)象一般不會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量。可以400g離心5分鐘，取上清，然后過濾。根據(jù)需要選擇合適的濾膜孔徑，一般常用的是0.22um
PES材質(zhì)的濾膜。為避免濾膜阻塞，建議離心后取上清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾而不是直接過濾血清。

　　總之，細(xì)胞培養(yǎng)是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基石，留心各種細(xì)節(jié)問題，嚴(yán)守滅菌處理的程序，保護(hù)好自己養(yǎng)的細(xì)胞，這樣才能快樂地進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。