污染，是PCR實驗室出現實驗假陽性、結果不可信的重要原因，PCR實驗室應當將防污染作為日常管理、實驗安排、清潔消毒、實驗習慣的核心。PCR 實驗污染和細胞污染是有差別的，PCR 實驗污染主要是核酸而不是細菌和其他入侵者。因此所有的預防措施都會稍稍有所不同。“易查不易察”，污染來的悄無聲息，我們該如何應對。今天給大家簡單介紹一下PCR實驗室的主要污染來源、實驗中如何避免和減少污染的可能性及實驗發生污染的應急處理方案。

PCR實驗室的污染來源

1、樣本間交叉污染：

收集樣本的容器被污染或樣本密封不嚴外溢；不同樣本移液時忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖；移液器等實驗器具及耗材未及時消毒滅菌；不同樣本同時開蓋或樣本劇烈震蕩、反復吹吸導致氣溶膠形成擴散，相互交叉污染。

2、實驗試劑污染：

主要是在 PCR 組分試劑加樣過程中，由于移液器、容器、陰性對照及其它試劑被核酸模板或陽性對照污染。 加樣過程中，因為 PCR 試劑對溫度十分敏感，需要通過冰浴使得 PCR 試劑和 PCR 板/管處于 0℃，但這個過程也是充滿了污染的風險的。

3、擴增產物污染：

大量拷貝的產物泄漏或擴增后的PCR反應管意外開蓋，這是 PCR 反應中最主要常見的污染問題。因為 PCR 產物拷貝量大，遠遠高于 PCR 檢測數個拷貝的極限，所以極微量的 PCR 產物污染，就可形成假陽性。

4、克隆質粒污染：

作為陽性質控品的克隆質粒外溢。

PCR實驗室的防污染方法

按照實驗室的安全工作制度或安全標準操作程序，所有操作符合《實驗室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。

1、嚴格執行各區功能劃分：

試劑儲存和準備區：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應混合液的準備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準備。

標本制備區：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴增反應管。對于涉及臨床樣本的操作，應符合生物安全二級實驗室防護設備、個人防護和操作規范的要求。

擴增區：cDNA合成、DNA擴增及檢測。

擴增產物分析區：擴增片段的進一步分析測定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測序等。

試劑準備區、樣本制備區和擴增區內的實驗用品，包括移液器等器具應專用，空氣、物品流向依次為：試劑準備區、樣本制備區、擴增區、產物分析區，不可逆行。

2、清潔的實驗用品：

實驗室自配試劑（去離子水、緩沖液等）和所有使用器具在使用之前均應高壓滅菌或紫外殺菌。槍尖、反應管等實驗耗材應一次性使用。

3、正確的實驗操作：

實驗應在超凈工作臺內進行，工作臺內應放置PCR專用的微量離心機、各量程的移液器和其他必須物品。

實驗的過程中選擇最合適尺寸的手套并能及時更換，在進出不同實驗區域或進行模板操作后都應更換實驗服、口罩、帽子及手套，以避免不同實驗區交叉污染。

裝有PCR試劑的反應管在打開之前應先瞬時離心，將管壁及管蓋上的液體離至管底，降低污染手套或加樣器的風險；謹慎開啟反應管，防止管內液體濺出或形成氣溶膠導致污染。

吸加試劑和模板的操作應嚴格按照規范要求進行，遵守“慢吸快打”原則，盡量一次性完成，忌多次抽吸，以避免氣溶膠產生的交叉污染。

PCR試劑建議小量分裝，以減少反復凍融、重復取樣次數；多樣本PCR反應時，先配制反應混合液分裝至反應管中，最后加入樣本核酸，請勿同時開蓋，盡量保證單人單管，實現*閉管操作。

實驗試劑應與樣品和PCR產物分開保存，不應放于同處。

PCR擴增實驗完成后及時將反應管取出，用一次性手套將產物反應管包裹丟棄，保證管蓋緊閉。

4、規范的實驗設計：

應遵循實驗室內部質量控制的相關規定，實驗中設立陽性對照、陰性對照和空白對照，全程質控實驗過程，驗證PCR反應的可靠性，并協助判斷擴增系統的可信性。

PCR實驗室的污染應急處理方法

1、若核酸樣本溢出：

立即用布或紙巾覆蓋，由外圍向中心傾倒10%的次氯酸消毒劑，約30分鐘后，清除污染物品，再用次氯酸消毒劑擦拭，并用75%酒精噴灑，移動紫外車定點照射1小時。

2、其他不明情況污染：

1、暫停所有實驗操作；

2、清理實驗室內所有物品，尋找污染來源；

3、加大實驗室的通風；

4、對實驗室內所有表面（臺面、地面及墻面） 進行消毒；

5、75%酒精空中噴霧；

6、開啟紫外消毒裝置，延長紫外照射時間（4小時以上）；

7、以上措施每日進行，直至污染消除；用新試劑及確認無污染的器材進行原污染項目的試劑空白檢測，連續3次均陰性后方可進行常規檢測。