固定化金屬離子親和色譜用于蛋白質及肽的分離分析

摘要：固定化金屬離子親和色譜（IMAC）作為一種新型色譜分離模式，已經被廣泛應用于蛋白質的分離分析。IMAC常作為捕獲/釋放柱，富集某一類肽段或蛋白質，以及含有組氨酸標簽的重組蛋白的分離純化。由于IMAC材料對于樣品的分析能力相對較弱，經過IMAC柱分級后的組分仍然十分復雜，因此，通常需要對這些組分進行進一步分離。針對這一問題，本文發展了一種可重復使用的IMAC 柱，并將其用于（一維及二維）液相色譜的分離。

Analytical Separations of ProteinsPeptides Using Immobilized Metal Affinity Chromatography

Patrick McCarthy, Mark Tracy, Terry Sheehan,Christopher Pohl

Abstract：Immobilized metal affinity chromatography （IMAC） is a well-established protein separation technique experiencing expanded use based on new, high-performance analytical phases. IMAC is commonly used in capture/release cartridges for enriching peptidesproteins of a certain class or Histagged recombinant protein purification. Due to the relatively high resolution of these cartridges, fractions collected from the cartridges can still be quite complex,further purification is generally required. To address this limitation, a reusable, high-resolution IMAC column that can be used for high-performance （1-D2-D） LC separations has been developed.

基于新型、高性能的固定相的固定化金屬離子親和色譜（IMAC）是一種信譽的蛋白質分離技術，近來受到廣泛的關注。IMAC 常作為捕集柱，用于富集某一特定類型的肽段或蛋白質（如表面含有裸露的組氨酸殘基或磷酸化的肽段/蛋白質），以及含有組氨酸標簽的重組蛋白的分離純化。由于IMAC 的分離柱效相對較低，經過IMAC 柱分級收集的組分仍然相當復雜，通常需要對其做進一步純化處理。針對這一問題，本文發展了一種可重復使用的IMAC 柱，并將其應用于（一維和二維）液相色譜的分離分析。

在本文中所設計的ProPac^?IMAC-10（Dionex Corp., Sunnyvale,CA）固定相能夠使蛋白質分子與固定相表面的納米粒子產生一對一的相互作用。通過這種方式，可以將預富集的蛋白與基質中的其他組分（如蛋白質、肽段、DNA 等）分離，同時也與相鄰的納米粒子所結合的組分分離。從概念上講，這種設計非常適于某一類蛋白質或肽的分離，柱上復性、柱上蛋白質與蛋白質的相互作用研究以及柱上定位反應（如定位生物素標記）。本文舉例說明了ProPac IMAC-10 對蛋白質及肽的分離能力。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

實驗所使用的試劑包括：氯化鈉（Fluka,Milwaukee，WI）；咪唑（Fluka）；尿素（Sigma, St. Loui s, MO）；乙腈（Burdick &Jackson, Morris Township, NJ）；去離子水，阻抗18MΩ?c m ；三氟乙酸（TFA）（Pierce Chemical, Rockford, IL）；十水合焦磷酸四鈉（TSPP），Na₄P₂O₇^-10H₂O（Sigma）；甲酸，
98%（EM Science, Gibbstown, NJ）；冰乙酸（J.T.Baker, Phillipsburg, NJ）；氨水（Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）；六水合三氯化鐵，FeCl₃^-6H₂O（Aldrich, Milwaukee, WI）；β -酪蛋白（Sigma）；2mm × 50 mm 和4 mm × 250mm ProPac IMAC-10 柱，以及4.6 mm × 150 mmAcclaim 300 C18 反相色譜柱（Dionex）。

1.2 儀器

色譜分離在Dionex 液相色譜系統上完成，其配置包括：AD20 檢測器、GP50 泵、AS50自動進樣器以及Chromeleon 色譜工作站。zui終的實驗儀器在配置了P680 DGP6 泵、TCC-100 柱溫箱、ASI-100TTM 自動進樣器、UVD 340U 檢測器以及Chromeleon 色譜工作站的二元梯度液相色譜系統上完成。

2 結果與討論

2.1 IMAC 的機理

采用IMAC 進行蛋白質分離主要基于其配位作用。對于IMAC- 銅色譜柱，暴露于基質表面的銅離子提供配位受體位點，能夠與蛋白質表面裸露的組氨酸殘基結合。用其分析核糖核酸酶A、肌紅蛋白和碳酸酐酶的晶體結構，其表面裸露的組氨酸數目分別約為4，9，15 個。這些蛋白質通過增加流動相中咪唑濃度的梯度洗脫模式實現分離（見圖1）。

2.2 帶有組氨酸標簽的蛋白分離（IMAC-Cu）

利用組氨酸標簽與IMAC 柱的作用，IMAC柱可用于重組蛋白的分離純化。分離通常包括三個步驟：首先，在特定的結合緩沖溶液條件下進行蛋白的上樣和捕集；淋洗去除雜質；zui后，洗脫富集的蛋白組分。通常，經過IMAC 柱純化后的蛋白，其純度不足以結晶及進行其他重要的活性測定。但是，ProPac IMAC-10 柱對于含組氨酸標簽的蛋白質具有非常強的純化能力，可以用于雜質的檢測及去除（見圖2）。

2.3 單克隆抗體的分離（IMAC-Cu）

當一個單克隆抗體（Mab）的變體數目增加時（如氧化、脫酰胺作用、賴氨酸切斷、唾液酸化、聚合等），樣品的非同源性也隨之增加。目前，用于Mab 變體分析的方法主要有陽離子交換、陰離子交換、疏水作用色譜（HIC）、體積排阻色譜（SEC）等模式。由于樣品的變體十分復雜，因此有關變體的分離以及定性分析，通常需要多種色譜分離模式聯合，結合木瓜蛋白酶或胰蛋白酶水解來實現。鍵合銅離子的ProPac IMAC-10 柱同樣適合上述物質的分離分析。圖3a 表示完整的單克隆抗體的分離，圖3b 為10 倍放大的結果。ProPac IMAC-10 能夠去除Mab 主峰上的未知雜質。若使用木瓜蛋白酶酶解，ProPac IMAC-10（Cu）能夠從Fc 碎片中分離出Fab 碎片（數據未給出）。

2.4 磷酸化肽的分離（IMAC-Fe）

以β - 酪蛋白為標準蛋白說明ProPac IMAC-10 柱在鍵合鐵離子模式下的作用。β - 酪蛋白經胰蛋白酶水解后， 得到單磷酸化肽（FQSpEEQTEDELQDK）和四磷酸化肽RELEELNVPGEIVESpLSpSpSpEESITR）。鍵合鐵離子的ProPac IMAC-10 柱所使用的流動相與反相色譜流動相兼容（TN705）。在本實驗中，二維分離在Dionex 二元梯度液相色譜系統上自動完成，自動的IMAC 富集以及反相分離的色譜結果如圖4 所示。圖4a 與圖4b 分別給出了在ProPacIMAC-10 柱上不保留的痕量組分及其反相分離的結果，圖4c 與圖4d 也給出了在ProPac IMAC-10柱上保留組分的洗脫及其反相分離的情況。單磷酸化肽和四磷酸化肽分別在5.8 和9.2 min 被洗脫（見圖4d）。

3 結論

ProPac IMAC-10 分析柱為復雜生物樣品的分離提供了一種強有力的工具，具有可重復使用、強大的常規分析能力以及的蛋白質分離能力等特點。由于該柱適宜于高壓分離，因而能夠在提高流速及高通量條件下使用。通過鍵合不同的金屬離子，可以實現不同分離的需求，而且金屬離子種類可以進行更換。由于該柱支持進行多次進樣，無須重新固載金屬離子，因此非常適用于自動化分析，能夠以不同形式滿足液相色譜及快速蛋白液相色譜（FPLC）分析的需要。

Additional Reading

Automated enrichmentanalysis of phosphopeptides using immobilized metal affinityRP chromatography with column switching. Tech.Note 705, LPN 1763. Dionex Corp., Jan 2006. Separation of an intact monoclonal antibodyfractionation of monoclonal antibody papain digest fragm ents using immobilized metal affinity chromatography. Appl. Note 177, LPN 1840. Dionex Corp