核苷酸是一類由嘌呤堿或嘧啶堿、核糖或脫氧核糖以及磷酸三種物質(zhì)組成的化合物，主要參與構(gòu)成核酸，許多單核苷酸也具有多種重要的生物學(xué)功能，如與能量代謝有關(guān)的三磷酸腺苷（ATP）、脫氫輔酶等。核苷類藥物，包括其衍生物是一類重要的抗癌藥物，也可作為抗病毒藥物來抑制病毒在人體內(nèi)的生長繁殖。這些化合物屬于大極性化合物，常規(guī)的反相色譜柱通常難以保留。而使用HILIC色譜柱會遇到同分異構(gòu)體的挑戰(zhàn)從而無法分離。

賽默飛黑科技

——Hypercarb 色譜柱

賽默飛黑科技——Hypercarb 色譜柱，填料為100%的多孔石墨化碳（PGC），球形全多孔顆粒。碳原子排列成六邊形為骨架的多片層結(jié)構(gòu)，沒有任何其它的亞孔或鍵合相。基于這一特點，Hypercarb色譜柱具有不同于硅膠基質(zhì)固定相的*性質(zhì)。Hypercarb的表面具有空間選擇性，可以分離幾何異構(gòu)體及其它結(jié)構(gòu)相近的化合物。Hypercarb對各種流動相溶劑都表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，pH在1-14之間的流動相皆可用于分離，這使其可在一次運行中對各種極性的化合物進行分析。基于Hypercarb*的疏水和電子云保留機理，它非常適合解決HPLC及LC/MS反相和HILIC應(yīng)用中的“問題”分離，能夠以超凡能力保留強極性化合物并分離結(jié)構(gòu)性質(zhì)接近的化合物。

小編通過兩個案例分享，采用Hypercarb色譜柱，挑戰(zhàn)極性化合物保留分離，如同帶上開掛神器，在堿性流動相條件下，充分保留和分離核苷酸、阿糖胞苷及其含有同分異構(gòu)體的磷酸化衍生物，對于其他類似結(jié)構(gòu)的極性化合物分離具有極大的參考意義。

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01

Hypercarb用于5種核苷酸保留分離

儀器：Vanquish Duo UHPLC

色譜柱：Hypercarb，100x3mm，3um（P/N 35003-103030）

流動相：A：0.3%甲酸水，用氨水調(diào)pH=9；B: 乙腈

流 速：0.8 mL/min

進樣量：5 μL

檢測波長：UV 254 nm

圖1  5種核苷酸分離效果

圖2 嬰幼兒配方全脂羊乳粉中核苷酸分離效果

圖3 5種核苷酸重復(fù)性譜圖（n=3）

使用Hypercarb色譜柱能有效分離全脂羊乳粉中5種核苷酸與其他雜質(zhì)，結(jié)果可靠，可滿足實驗室檢測需求。圖3為5種核苷酸的重復(fù)性譜圖，可以看到重復(fù)性良好，保留時間和峰面積RSD均＜1%。

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02

Hypercarb用于阿糖胞苷及其磷酸化衍生物保留分離

儀器：Vanquish Duo UHPLC

色譜柱：Hypercarb，100x3mm，3um（P/N 35003-103030）

流動相：A：己胺 (5mM) ，加入DEA (0.4%, v/v), 用冰醋酸調(diào)pH=10；B: 乙腈/水 (1/1, v/v)

流 速：1 mL/min

進樣量：20 μL

檢測波長：UV 272 nm

圖4 7種阿糖胞苷類化合物分離

圖5 7種阿糖胞苷類化合物重復(fù)性譜圖（n=6）

使用Hypercarb色譜柱保留和分離阿糖胞苷及其磷酸化衍生物，所有化合物均能基線分離，5號峰CTP與7號峰Ara-CTP這兩種非對映異構(gòu)體分離。7種阿糖胞苷類化合物在Hypercarb色譜柱上連續(xù)6針進樣，重復(fù)性表現(xiàn)優(yōu)異，保留時間和峰面積RSD＜2%。

本方案開發(fā)基于LC-UV，能夠分離頗具挑戰(zhàn)的非對應(yīng)異構(gòu)體CTP與Ara-CTP，對于有低濃度分析要求的實驗室，該方案可根據(jù)實際需求應(yīng)用于LCMSMS。

今天的分享就到這里啦，大家是不是對Hypercarb保留分離極性化合物更有信心呢？想要獲取更多信息，歡迎掃描下方二維碼獲取應(yīng)用報告“Hypercarb色譜柱用于核苷酸類及其磷酸化衍生物的分析”，下期再會！

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