本期講堂，作為PCR基礎知識的開篇，我們先來了解一下最基礎的PCR原理、操作流程、成功的要素這三部分內容。

PCR作為一項基礎的分子生物學技術，由于操作簡便、省時、靈敏度高等優點，在生物科學研究領域應用廣泛：從克隆、基因編輯、下一代測序（NGS）到基因分型、法醫zhencha、病原鑒定等，都離不開PCR技術的助力分析。

首先我們先來了解一下PCR的原理，

一、PCR原理

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈式反應，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。是一項DNA體外合成放大技術，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA?？捎糜诨蚍蛛x克隆，序列分析，基因表達調控，基因多態性研究等許多方面。

理論上，每一輪循環可使DNA的數量增加一倍，經過n次循環后，反應混合物中所含的DNA數量為2n。

二、PCR操作流程

①DNA制備

從樣品中提取PCR反應所需的DNA模板、直接PCR無需此步。
推薦商品化的核酸提取試劑，節省時間、簡化操作流程、減少DNA提取量的損失。

②PCR反應

包括反應液的制備和PCR反應兩個步驟。

反應液的制備
普通PCR的反應體系由DNA聚合酶、PCR反應緩沖液、4 種dNTP、引物及靶序列DNA模板這五大要素組成。商品化的DNA聚合酶，一般包含了適宜濃度的dNTP及最適反應緩沖液，因此僅需我們準備引物及DNA模板，并且根據說明書推薦量進行反應液配制即可。

PCR反應
選擇適宜的梯度PCR儀，根據擴增片段大小及酶制品說明書推薦來進行PCR反應條件設置。

③電泳、染色

PCR反應后，通過凝膠電泳確認擴增片段大小。

三、PCR成功的要素

DNA聚合酶、PCR反應緩沖液、4 種dNTP、引物及靶序列DNA模板是構成PCR反應組分的五大要素，這是影響PCR成功的內因；PCR反應條件的設置，是影響PCR成功的外因。

酶 

之前提到過商品化的DNA聚合酶，一般包含了適宜濃度的dNTP及最適反應buffer，因此酶的選擇至關重要，我們需要兼顧保真性、擴增特異性、擴增速度、擴增效率、模板復雜程度及擴增片段長度等，選擇最適PCR酶。

引物

引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR反應引物的濃度一般在0.1μm~1μm之間，以zuidi引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

模板

模板的完整性要好，模板降解會導致PCR擴增無產物。同時模板純度也盡量越純越好，純度不好，可用PCI（苯酚氯仿抽提）及EtOH（乙醇沉淀 ）精制。

模板添加量可以參考酶制品說明書及下表的建議模板量進行添加，加量過多會導致非特異性擴增產物增加：

反應條件

PCR反應條件可以參考酶制品說明書及下表進行設置：

四、常見問題

1.假陰性

不出現擴增條帶。PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及溴乙錠的使用， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不*。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。

2.陰性

需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。

3.假陽性

出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。

靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

出現非特異性擴增帶：PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不*互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。

出現片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環次數。