水分是藥品常用的檢測項目, 常應(yīng)用于原料藥或其制劑的檢查, 在藥品檢測領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用, 已為各國藥典廣泛收載。檢測實驗室進(jìn)行水分測定的水平可以客觀地、較有代表性地反映出該實驗室的藥品檢測能力。藥品中水分測定的影響因素較多, 如費休氏試液的標(biāo)定液滴定度的影響、溶劑用量及溶解時間的影響、稱樣量的影響、滴定儀器的影響等, 需要較高的技術(shù)能力^[1]。

能力驗證是實驗室質(zhì)量保證體系中的一個重要組成部分。參加能力驗證活動是評價實驗室檢測水平, 鍛煉人員技術(shù)能力, 促進(jìn)實驗室認(rèn)可和交流的重要手段^[2]。我國在檢測和校準(zhǔn)實驗室的國家認(rèn)可制度中對實驗室參加能力驗證并取得滿意結(jié)果提出了明確的要求^[3]。

本次研究通過組織藥品中水分測定的能力驗證計劃可以使參加實驗室了解國內(nèi)藥品及其他相關(guān)檢測領(lǐng)域的整體水平, 為這些領(lǐng)域的管理和CNAS的認(rèn)可提供信息;同時也可以使參加實驗室識別實驗室間存在的差異, 促進(jìn)實驗室共同提高水平;CNAS也可以通過比對, 發(fā)現(xiàn)、分析并解決問題, 監(jiān)控認(rèn)可實驗室檢測能力的維持情況^[7,8,9,10]。檢測方法參照中國藥典2010年版二部附錄ⅧM, “水分測定法”第y1法 (費休氏法) , A (容量滴定法) 測定水分。

鑒于藥品水分的質(zhì)量控制要求, 本研究對國內(nèi)166家藥品、獸藥等檢測機構(gòu)的藥品水分測定能力進(jìn)行測試, 研究水分測定能力驗證的樣品制備、均勻性與穩(wěn)定性、結(jié)果統(tǒng)計、能力評價等情況, 并對測試結(jié)果進(jìn)行討論。

1 儀器與試藥

廈門群隆卡氏水分儀  ;無水甲醇 (分析純, ) ;費休氏試液 (分析純, ) ;純化水。樣品來源為市售進(jìn)口品牌 (Fluka試劑) 分析純試劑。

2 方法

2.1 測試樣品制備

本次能力驗證研究采用單一樣品設(shè)計, 樣品為酒石酸二鈉二水合物, 該物質(zhì)不吸水, 也不失水, 具有良好的穩(wěn)定性, 美國藥典作為標(biāo)化費休氏滴定液的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或用于水分測定的質(zhì)控物質(zhì)。在溫度為 (25±2) ℃、相對濕度≤50%的環(huán)境下, 將樣品分裝到透明玻璃瓶中, 用鋁蓋壓緊密封。共制備樣品250瓶, 每瓶裝量約為1.0 g。分裝后的樣品按照單盲樣品分配表分配, 向每個參加者提供1份白色粉末樣品。

2.2 樣品均勻性和穩(wěn)定性檢驗

在所有樣品中, 以隨機方式抽取10瓶樣品用于均勻性檢驗, 對于抽取的每瓶樣品, 在重復(fù)性條件下測試3次。檢測方法參照中國藥典2010年版二部附錄ⅧM, “水分測定法”第y1法 (費休氏法) , A (容量滴定法) 測定水分。

取完整包裝的樣品各6瓶, 分別置于 (1) 室溫條件下 (濕度:50%以下) ; (2) 40℃、75%RH條件下; (3) 25℃、92.5%RH條件下;在第0 d取 (1) 條件下樣品3瓶;在第10 d取 (2) 、 (3) 2個條件下樣品各3瓶、第30 d取 (1) 、 (2) 、 (3) 條件下樣品各3瓶進(jìn)行穩(wěn)定性考察。每瓶在重復(fù)性條件下測定3次。

2.3 測定要求

能力驗證研究對每個參加實驗室隨機安排一個唯y1性代碼, 代碼為001至166, 向每個參加實驗室發(fā)送樣品1瓶, 同時附有作業(yè)指導(dǎo)書、結(jié)果報告單和被測物品接受狀態(tài)確認(rèn)表等, 要求各參加實驗室按照作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行測定, 并在規(guī)定期限內(nèi)上報測試結(jié)果。測試結(jié)果以%為單位, 結(jié)果保留4位有效數(shù)字。

2.4 結(jié)果統(tǒng)計分析方法

依據(jù)CNAS制訂的分析實驗室能力驗證的統(tǒng)一要求^[4], 能力驗證采用穩(wěn)健 (Robust) 統(tǒng)計技術(shù)處理實驗室的檢測結(jié)果。即采用穩(wěn)健統(tǒng)計的中位值作為值, 標(biāo)準(zhǔn)化四分位距 (NIQR) 為變動性度量值 (目標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)偏差) 計算各實驗室結(jié)果的Z比分?jǐn)?shù) (Z值) 。根據(jù)單一樣品的結(jié)果計算實驗室Z比分?jǐn)?shù)。

按下式計算Z值:

式中:x-參加者測試結(jié)果;X-值;NIQR-標(biāo)準(zhǔn)化四分位距。

涉及的統(tǒng)計量有結(jié)果數(shù)、中位值及其不確定度、標(biāo)準(zhǔn)化四分位距 (NIQR) 、穩(wěn)健的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD) 、小值、大值和極差等。

Z比分?jǐn)?shù)評價實驗室的結(jié)果, 即:若∣Z∣≤2, 檢測結(jié)果為滿意結(jié)果;若2<∣Z∣<3, 檢測結(jié)果為有問題結(jié)果;若∣Z∣≥3, 檢測結(jié)果為不滿意結(jié)果或離群值。

3 結(jié)果與統(tǒng)計分析

3.1 測試樣品均勻性檢驗結(jié)果

隨機抽取本次能力驗證樣品10瓶, 按中國藥典2010年版二部附錄ⅧM, 第y1法 (費休氏法) , A (容量滴定法) 測定水分。每瓶樣品在重復(fù)性條件下測定3次。采用單因子方差分析法 (one way ANOVA) ^[5]對檢驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計處理, 結(jié)果表明在置信度95%時樣品的均勻性均滿足要求。

臨界值:F_{0.05 (9, 20)} =2.39, 統(tǒng)計量F小于此值。這表明在α=0.05顯著性水平時, 樣品是均勻的。

3.2 測試樣品穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

取完整包裝的樣品各3瓶, 按“2.2”項下的試驗條件進(jìn)行樣品水分的穩(wěn)定性考察。采用t檢驗法^[5]評價樣品在3個條件下第n d和第0 d (均勻性檢驗樣品) 水分測定結(jié)果的一致性。結(jié)果表明, 兩者間無顯著性差異, 樣品的穩(wěn)定性滿足要求。

查表得在顯著性水平α=0.05, 自由度為37 (n₁+n₂-2) 時t_0.05, 37的臨界值為2.026, 樣品水分測定值的統(tǒng)計量t均小于該臨界值。這表明在此顯著水平時, 樣品在3個條件下放置10 d、30 d與第0 d均勻性實驗時的水分測定結(jié)果無顯著性差異, 即經(jīng)過加速穩(wěn)定性考察的樣品與均勻性檢驗的樣品結(jié)果無顯著性差異。

從發(fā)送樣品到實驗室收到樣品并完成檢驗不超過30 d時間, 且這段時間中樣品于常溫條件下保存, 樣品的穩(wěn)定性能滿足要求。

3.3 藥品水分測定能力驗證結(jié)果

提交檢測結(jié)果的實驗室共166家, 將所有水分測定結(jié)果繪制頻率分布圖。從圖1可見, 樣品的檢測結(jié)果基本呈單峰分布, 峰形大致對稱。基于這種數(shù)據(jù)分布, 依據(jù)規(guī)定^[6], 適合采用穩(wěn)健統(tǒng)計方法評價各參加實驗室的測試結(jié)果。

關(guān)于值的計算, FAPAS優(yōu)先采用的是計算參加實驗室的Huber Robust均數(shù), 而國內(nèi)普遍采用的是NATA和CNAS推薦的中位值法^[11]。其實, 當(dāng)數(shù)據(jù)為單峰和大致對稱時, 中位值或Huber Robust均數(shù)的數(shù)值是相近的。本次能力驗證采用CNAS推薦的穩(wěn)健統(tǒng)計中位值法^[4]。

圖1 參加實驗室檢測結(jié)果頻率分布圖

穩(wěn)健統(tǒng)計方法是一種不易受到異常值影響的統(tǒng)計方法。在通常采用的統(tǒng)計方法中, 計算一組數(shù)據(jù)的平均值 (mean) 容易受到異常值影響, 而在穩(wěn)健統(tǒng)計方法中, 是以中位值 (median) 代替平均值, 以歸一化IQR代替標(biāo)準(zhǔn)偏差。因此能準(zhǔn)確反映出數(shù)據(jù)的統(tǒng)計特征。

提交結(jié)果的166家實驗室參與了統(tǒng)計, 其中139家的結(jié)果為滿意, 16家的結(jié)果有問題, 11家的結(jié)果為不滿意。

能力驗證的結(jié)果通常可使用Z比分?jǐn)?shù)柱狀圖表示, 見圖2, 該圖不但能幫助組織者解釋結(jié)果, 對于參加者也非常有用, 特別對那些帶有離群值的參加者, 能夠看到他們提交的結(jié)果與其他實驗室結(jié)果的差異, 從而對實驗室能力進(jìn)行評估。

圖2 實驗室Z比分?jǐn)?shù)柱狀圖

4 技術(shù)分析和建議

根據(jù)王君等^[12]發(fā)表的“費休氏水分測定法的不確定度評定”一文中的各個不確定度分量并結(jié)合本次能力驗證各參加單位的結(jié)果報告, 共篩選出了以下幾個方面闡述費休氏水分測定的技術(shù)難點。

4.1 費休氏試液的標(biāo)定

費休氏試液的標(biāo)定, 中國藥典是選用純化水精密稱定后用費休氏試液滴定進(jìn)行標(biāo)定, 標(biāo)定應(yīng)取3份以上, 且3次連續(xù)標(biāo)定的結(jié)果其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)在1%以內(nèi), 方能進(jìn)行供試品水分的測定。

從結(jié)果來看, 共27家參加者的結(jié)果可疑或不滿意, 其中有5家標(biāo)定數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差超過1%, 有的甚至高達(dá)3.74%, 說明標(biāo)定過程沒有達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài), 這樣計算得出的F值是不準(zhǔn)確的, 這可能是導(dǎo)致終結(jié)果偏差的直接原因;另有部分實驗室未提供標(biāo)定數(shù)據(jù), 無法考證其標(biāo)定的準(zhǔn)確性, 這也反映部分實驗室在日常的實驗過程中沒有很好地關(guān)注這個關(guān)鍵步驟。

文獻(xiàn)報道^[12]水的重量引入的不確定度分量大, 占結(jié)果不確定度的66%以上, 且水的重量要求達(dá)到10 mg以上, 才能得到可靠結(jié)果。個別參加者在標(biāo)定時稱取純化水的量低于10 mg, 而中國藥典規(guī)定標(biāo)定時取純化水10~30 mg, 取樣量減少也可能導(dǎo)致結(jié)果的不準(zhǔn)確性增大, 導(dǎo)致了能力驗證結(jié)果為不滿意。

4.2 滴定度的影響

費休氏試液滴定度太低或太高對滴定的準(zhǔn)確性也有一定的影響, 當(dāng)?shù)味ǘ容^低時, 需要消耗大量的滴定液, 使滴定時間延長, 在滴定過程中也可能更多地引入空氣中的水分, 從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性;滴定度太高有可能使消耗的滴定液過少, 滴定體積的微量變化就可能影響結(jié)果, 造成偏差。本次各參加實驗室費休氏試液的滴定度大多為3~5 mg·m L^-1, 但有個別實驗室的滴定度較低, 消耗滴定液的體積大于5 m L, 若滴定管體積為5 m L, 則多次讀數(shù)將引入誤差, 已經(jīng)產(chǎn)生錯誤操作, 其結(jié)果必然影響準(zhǔn)確性。

4.3 稱樣量的因素

文獻(xiàn)報道^[12]第三大不確定度分量是樣品的稱樣量, 占結(jié)果不確定度的6.4%。作業(yè)指導(dǎo)書推薦供試品取樣量為70~90 mg, 是考慮到應(yīng)使消耗的費休氏試液在一定體積范圍之間方能準(zhǔn)確測定, 但是仍有個別實驗室取樣量過低, 有的甚至為20 mg, 過低的取樣量直接導(dǎo)致消耗的費休氏試液量過低或與純化水的標(biāo)定所消耗的費休氏試液量相差太大, 從而引入的不確定度分量增大, 使結(jié)果不滿意。

4.4 溶劑用量及溶解時間的影響

供試品在溶劑中是否*溶解直接影響到水分測定的結(jié)果, 作業(yè)指導(dǎo)書中明確告知各實驗室“本品在甲醇中微溶”, 但有部分實驗室沒有關(guān)注其溶解性的問題, 在供試品取樣量為70~90 mg的情況下, 無水甲醇的用量有20 m L、10 m L甚至5 m L的, 過低的溶劑量有可能造成供試品沒有*溶解, 從而影響水分測定的結(jié)果。另有部分實驗室沒有提供無水甲醇的用量, 也說明實驗室沒有充分考慮到溶劑溶解性的問題。另外如果樣品加入溶劑后直接測定, 溶解時間不充分的話也會影響檢測的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。部分結(jié)果不滿意及可疑的實驗室原始記錄上也未能體現(xiàn)溶解時間, 這可能造成3份結(jié)果之間偏差過大或結(jié)果偏離的原因之一。

4.5 滴定儀器

有個別參加者采用較老式的玻璃水分測定儀 (手動滴定) , 這種儀器對人員的操作技術(shù)要求較高, 由于放置樣品的容器與空氣不*隔絕, 當(dāng)環(huán)境濕度較大, 人員操作較慢, 人員對終點判斷的準(zhǔn)確性有欠缺, 以及由于系統(tǒng)不密閉情況下滴定液容易吸收空氣中的水分等諸多因素都會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性, 終導(dǎo)致結(jié)果可疑或不滿意。

另外, 水分的測定對卡氏水分儀器的密封性能要求很高, 新購的卡氏水分儀密封性能較好, 但隨著使用時間的延長, 密封程度會有所變化:密封圈的老化, 干燥劑的失效, 長時間不使用導(dǎo)致儀器內(nèi)部管路、滴定瓶、溶劑等吸附環(huán)境水分, 使測定過程出現(xiàn)終點延長, 重現(xiàn)性差, 結(jié)果偏大等一系列問題, 所以實驗室應(yīng)該注重儀器日常的維護(hù)保養(yǎng)及檢定、校準(zhǔn)、期間核查等工作, 在使用前也應(yīng)及時更換干燥劑或在必要時更換密封圈等。