High Performance Liquid Chromatography

 Analysis  of  Saccharides

HPLC 糖類的分析

1. 簡介

糖，包括食糖，是自然界廣泛生成的一類有機化合物，是我們身體的主要能源、人體組成的要素，同時也是參與多種生理功能的重要物質，在我們人體中起著非常巨大的作用。因此，糖類的分析是生理學領域中的基本部分。糖類分析zui通用的方法是液相色譜法(HPLC)。本文將介紹HPLC分析糖類主要的分離和檢測方法。

2. 糖類的分析方法

糖類的種類繁多，分子量從180的單糖(例如葡萄糖)到幾百上千一直到幾百萬的淀粉。單糖又被分為中性糖(如葡萄糖)、氨基糖(如氨基葡糖)、糖醛酸(如葡糖醛酸)和糖醇(如山梨醇)。另外，每種糖都有許多異構體。

因此，用HPLC分析糖一定要有效地應用的分離和檢測方法，還要考慮樣品化合物的濃度和類型。表1列出了HPLC糖分析的分離及檢測的方法。

表1 分離和檢測

                     凝膠色譜法

      分離           正相色譜法

                     配位體交換色譜法

                     陰離子交換 色譜法

                     紫外吸收檢測

      檢測           示差折光檢測

                     衍生(化學反應檢測)

3. 糖的HPLC分離方法

3.1 凝膠色譜法

凝膠色譜法是基于糖分子的大小進行分離的方法。按照慣例我們可以使用右旋糖酐(dextran)和聚丙烯酰胺(polyacrylamide)凝膠作為柱填料，但是這些凝膠的缺點是不耐高壓，現在zui通用的填料是新開發的可耐高壓的聚苯乙烯磺酸鈉和聚甲基丙烯酸酯甘油(glyceryl polymethacrylate)凝膠。

圖1 顯示的是幾種不同孔徑凝膠色譜柱分析聚乙二醇的校正曲線。

圖2 是用經過選擇適合樣品的分子量

范圍的孔徑的凝膠色譜柱分析葡聚糖的洗

脫圖。

條件：

色譜柱： 500mmx8.0mm i.d.

流動相： 水

流速：   1.0ml/min

溫度：   25 ℃

檢測器： 示差折光檢測器

峰：

  1.dextran MW500K,  2.dextran MW250K,  3.dextran MW150K,  4.dextran MW70K,

  5.dextran MW20K,    6.dextran MW10K,    7. 1,2-亞乙基二醇(HOCH2CH2OH)

值得注意的是用聚苯乙烯磺酸鈉凝膠色譜柱分析酸性的糖時，由于離子的排斥作用，洗脫非常快，而分析基本糖類時，由于離子的相互作用，洗脫的要慢的多。

3.2 正相色譜法

正相色譜法分析從單糖到低聚糖非常有效，它甚至可以把低聚糖分離成單一組份以便定性。過去，正相色譜法分析糖時，用磺酸鹽型陰離子交換樹脂或鋰和銨鹽的正離子交換樹脂作填料，用乙醇/水作流動相，但不幸的是，分析通常要耗時一小時以上。現在，用硅膠固定相和氨丙基(aminopropyl)化學結合作柱填料，乙腈(acetonitrile)和水作流動相，糖在色譜柱中的保留取決于糖的劃分。

圖3 是糖標準品的色譜圖

條件：

色譜柱：Shim-pack CLC-NH2

        氨基柱(150mm X 6.0mm i.d.)

流動相：乙腈/水=7/3(V/V)

流  速：1.0mL/min

溫  度：25℃

檢測器：示差折光檢測器

色譜峰：

1：丙三醇(glycerol)，2：木糖(xylose)，3：阿拉伯糖(arabinnose)，4：果糖(fructose)，

5：葡萄糖(glucose)，6：半乳糖(galactose)，7：蔗糖(sucrose)，8：麥芽糖(maltose)，

9：異麥芽糖(isomaltose)，10：麥芽三糖(maltotriose)

圖4 是同上色譜條件糖類的保留時間

1：溶劑，2：鼠李糖(rhamnose)，3：木糖(xylose)，4：來蘇糖(lyxose)，5：巖藻糖(fucose)，

6：阿拉伯糖(arabinose)，7：山梨糖(sorbose)，8：果糖(fructose)，9：甘露糖(mannose)，

10：葡萄糖(glucose)，11：山梨醇(sorbitol)，12：甘露糖醇(mannitol)，13：半乳糖(galactose)，

14：蔗糖(sucrose)，15：纖維素二糖(cellobiose)，16：麥芽糖(maltose)，17：麥芽糖醇(maltitol)，

18：肌醇(inositol)，19：海藻糖(trehalose)，20：異麥芽糖(isomaltose)，21：乳糖(lactose)，

22：蜜二糖(melibiose)，23：麥芽三糖(maltotriose)，24：蜜三糖(raffinose)，

25：麥芽四糖(maltotetraose)，26：麥芽五糖(maltopentaose)

正相色譜法可以分離二糖酶(disaccharides)，這對于體積排除法和配位體交換法很困難。正相色譜法分析中，通過調整乙腈和水的比率可以控制糖的分離及保留時間，增大水的濃度，可以加快糖的洗脫，并使大分子量的糖加快到合理的時間洗脫出來。

圖5 是葡萄糖及其低聚物(二聚物(dimer)到

     六聚物(hexamer))的色譜圖

條件：

色譜柱：Shim-pack CLC-NH2

        氨基柱(150mm X 6.0mm i.d.)

流動相：乙腈/水=6/4(V/V)

流  速：1.2mL/min

溫  度：25℃

檢測器：示差折光檢測器

色譜峰：

1：葡萄糖， 2：麥芽糖， 3：麥芽三糖(maltotriose)，4：麥芽四糖(maltotetraose)，

5：麥芽五糖(maltopentaose)，6：麥芽六糖(maltohexaose)

在此分析中，水的濃度增加到了40%，進一步增加水的濃度，可以分離含有10至15個葡萄糖分子的化合物。相反，降低水的濃度，可以改善單聚物(monomer)的分離，但是，如果濃度低于20%，由于溶解度的降低，有時會出現不對稱峰。作為流動相，乙基乙酸丙酮(acetone-ethyl acetate)/水也可以用于糖類的分析，它的特點是毒性比乙腈/水低。近來，樹脂(不是硅膠)色譜柱在正相色譜法中越來越流行，由于填料不易水解(hydrolyze)，所以樹脂色譜柱更耐用。也有些學者提出用十八烷基(octadecyl)和硅或硅膠化學結合作色譜柱，乙腈/水加胺(amine)作流動相來分析糖類。

3.3 配位體交換色譜法

用聚苯乙烯磺酸鈉凝膠(sodium sulfonated polystyrene gel)色譜柱無法分離相同分子量的二聚糖和更高分子量的糖，但是，它可以分離一些相同分子量的單糖，象葡萄糖和果糖。配位體交換色譜法是又一種HPLC分析糖的方法，通過選擇Ca+、Na+、Pb+ 等相對離子(counter-ion)，可以改變單糖的選擇性，從而改善它們的分離。此種方法有一個廣為人知的優點，就是只用水作流動相，分析簡單，因此，近來一系列各式各樣相對離子的色譜柱已經得到了廣泛的商業應用。

在分析過程中，糖主要通過與金屬性的相對離子結合而被保留，保留時間取決于它們和金屬性相對離子的水合分子相互作用所產生的結合物的穩定性。圖6、圖7和圖8分別提供了含有Na、Ca、Pb的聚苯乙烯磺酸鹽硅膠色譜柱分析糖所得到的色譜圖。

圖6.使用Na型柱Shim-pack SCR-101N

條件：

色譜柱：Shim-pack SCR-101N

        (300mm x 7.9mm i.d.)

流動相：水

溫  度：60℃

流  速：0.6mL/min

色譜峰：

1：葡聚糖MW10K(dextran MW10K)，2：蔗糖，3：葡萄糖，4：果糖，5：酒精(ethanol)

圖7.使用Ca型柱Shim-pack SCR-101C

條件：

色譜柱：Shim-pack SCR-101C

        (300mm x 7.9mm i.d.)

流動相：水

溫  度：80℃

流  速：1.0mL/min

色譜峰：

1：葡聚糖MW10K(dextran MW10K)，2：麥芽三糖，

3：麥芽糖，4：葡萄糖，5：果糖，

6：丙三醇(glycerol)，7：酒精，8：山梨醇(sorbitol)

圖8.使用Pb型柱Shim-pack SCR-101P

條件：

色譜柱：Shim-pack SCR-101P

        (300mm x 7.9mm i.d.)

流動相：水

溫  度：80℃

流  速：0.6mL/min

色譜峰：

1：蔗糖，2：葡萄糖，3：木糖(xylose)，

4：半乳糖(galactose)，5：阿拉伯糖，6：果糖，

7：丙三醇(glycerol)，8：甘露糖醇(mannitol)，9：核糖(ribose)，10：山梨醇(sorbitol)

圖9.列出了糖的保留時間，Ca柱分離單糖的效果比Na柱好，而Pb柱得到更好的分離效果；Ca柱和Pb柱對糖醇的保留長一些，可以分離葡萄糖和山梨醇，這對于Na柱是作不到的。在配位體交換色譜法分析中，色譜柱要保持較高的溫度，圖10 表示色譜圖隨溫度變化的關系。當色譜柱保持室溫時，葡萄糖，一種還原糖，分成了兩個峰，這是端基異構體(anomer)造成的，隨著溫度的增加，變旋作用的速度也隨之增強，兩個峰逐漸合為一個峰。另一方面，羥基(OH- )對變旋作用起著催化劑的作用，在流動相中加入象三乙胺(triethylamine)這樣的化合物，和升高柱溫的效果是相同的，在這種情況下，色譜柱要換成Ca柱。

圖9.Shim-pack SCR分析糖的洗脫時間

1：蜜三糖，2：麥芽三糖，3：蔗糖，4：麥芽糖，5：乳糖，6：葡萄糖，7：甘露糖醇，

8：鼠李糖，9：山梨醇，10：半乳糖，11：甘露糖，12：木糖，13：果糖，14：肌醇，

15：木糖醇，16：巖藻糖，17：阿拉伯糖，18：丙三醇，19：核糖，20：乙醇

圖10.溫度對分離的影響

條件：

色譜柱： Shim-pack SCR-101C (300mm x 7.9mm i.d.)

流動相：水              流速：0.8mL/min

色譜峰：1：蔗糖，2：葡萄糖，3：山梨醇

3.4 陰離子交換色譜法

糖的羥基團呈弱酸性，分裂常數也很低，約為10-12。因此，在陰離子交換色譜法分析糖時，流動相的PH值要大于12，并且HPLC系統也要經受同樣的條件。然而，還有另外一種交換的方法，就是由于象糖類這樣的聚羥基(polyhydroxy)化合物可以和硼酸(boric acid)反應產生帶負電荷的聯合體(如圖11)，因此，用硼酸緩沖溶液作流動相，通過糖和硼酸反應，可以進行糖的分析。

圖11： 

圖12.是一個用Shim-pack ISA-07色譜柱得到的典型的陰離子交換法分析糖的色譜圖。糖/硼酸聯合體陰離子交換對二聚糖和單糖的*分離非常有效，它提供的分離度遠遠好于其它方法，不幸的是，不同組份的保留時間差別很大，二聚糖和單糖的分離要耗費很長時間，色譜峰也比較寬，在同等條件下，不可能有高的分析效率。目前，分析中通常使用梯度模式，硼酸緩沖溶液和流動相的PH值隨時間的變化而變化，因此，也需要恰當的檢測方法與之相適應。

圖12.用Shim-pack ISA-07色譜柱得到的典型的陰離子交換法分析糖的色譜圖

條件：

色譜柱：Shim-pack ISA-07

        (250mm x 4.0mm i.d.)

流動相：300mM(鉀potassium)

        硼酸鹽(borate)緩沖液

流  速：0.6mL/min

溫  度：65℃

檢  測：精氨酸(arginine)柱后衍生 熒光 Ex:320nm, Em:430nm

色譜峰：

1：甘露糖，2：果糖，3：半乳糖，4：木糖，5：葡萄糖

4. 糖的檢測方法

4.1 吸收檢測法

紫外( ultraviolet )吸收分光光譜法是HPLCzui通用的檢測方法， 可是由于糖的吸收波長較短(約在190nm)， 在此波長下， 流動相和雜質的影響較大，所以它不太適用于糖類的分析。但糖醛酸(uronic)和唾液酸(sialic acid)的吸收波長約在200至210nm，因而可以用這種方法檢測。圖13為血清酸性水解物中唾液酸的色譜圖。

條件：

色譜柱：Shim-pack SCR-101H

        (300mm x 7.9mm i.d.)

流動相：10mM磷酸水溶液

流  速：1.5mL/min

溫  度：55℃

檢測器：205nm

4.2 示差折光檢測法

示差折光檢測器目前廣泛地應用于HPLC糖的檢測，高靈敏度、穩定的示差折光檢測器的利用，可以使我們檢測到低于100ng的糖，圖14是高靈敏度HPLC檢測糖的譜圖。盡管經常使用這種檢測器分析糖，但當我們作痕量分析特別象生化樣品這樣雜質較多的樣品時，往往得不到令人滿意的結果。還有一個不足之處，就是它不能用于梯度洗脫，這就意味著它不能用于硼酸緩沖溶液的陰離子交換法(見第3.4節)，影響多組份樣品的分析。

圖14 示差折光檢測器測糖

條件：

色譜柱：Shim-pack SCR-101N

        (300mm x 7.9mm i.d.)

流動相：水

流速：  1.0mL/min

溫度：  50℃

檢測器：示差折光檢測器

色譜峰：

1.蔗糖，2.葡萄糖，3.果糖，各200ng

4.3 衍生(化學反應檢測法)

在液相色譜法中，經常通過選擇適當的試劑與樣品衍生，使之在紫外或可見波段產生吸收，或產生熒光，以增強檢測的靈敏度和選擇性。這種方法在需要準確無誤地檢測出混合樣品中痕量化合物的生化領域特別有效。許多衍生的方法已經被開發出來，并被廣泛地應用。

衍生法在HPLC分析糖時也非常有效，又分為柱前衍生和柱后衍生。

4.3.1 柱前衍生法

在柱前衍生法中，由于目標化合物優先在進入分析柱之前衍生，因此試劑、反應時間、反應溫度等條件，比起柱后衍生法來說，可以在較寬的范圍內選擇，即使反應試劑被檢測出來，只要把它和目標化合物分離，也不會產生問題，但樣品的前處理要簡單而快速。對于柱前衍生法分析糖，用肼(dansylhydrazine)和 2-氨基嘧啶(2-aminopyridine)作試劑，酯化作用法和熒光衍生法均非常有效。在糖蛋白寡糖鏈的分析中，2-氨基嘧啶作試劑有著特殊的效果。

4.3.2 柱后衍生法

在柱后衍生法中，目標化合物在分離后被衍生。這種方法有幾個條件必須被滿足：由于衍生試劑是連續地被加入到流動相中，因此它不能被檢出；為保證良好的峰形，反應時間要盡可能的縮短；zui后，為使系統設計簡練和操作簡單，試劑的數量要盡可能少。盡管有這些要求，柱后衍生法還是有許多引人注目的優點，它有良好的重現性和線性，更適合于自動分析。

圖15是島津公司糖分析系統(梯度洗脫系統)的流路圖，該系統采用柱后熒光衍生法，精氨酸(arginine)作衍生試劑。

圖中裝置分別為：

1：泵，2：流動相，3：進樣器，4：色譜柱

5：柱箱，6：泵，  7：試劑， 8：反應器

9：反應室，10：熒光檢測器，

11：數據處理機，12：阻尼器，13：廢液

總之，正相色譜法、凝膠色譜法、配位體交換色譜法都可以分析糖類，但用硼酸緩沖溶液的陰離子交換色譜法可以得到*的效果。圖16是一個高靈敏度分析的實例，圖17是梯度洗脫系統的實例。另外，電化學檢測器也可以用于糖的分析。

圖16.    條件：

色譜柱：Shim-pack ISA-07

        (250mm x4.0mm i.d.)

流  速：0.6mL/min

溫  度：65℃

流動相：300mM(鉀potassium)硼酸鹽緩沖液

檢  測：精氨酸柱后衍生法，熒光：Ex320nm，Em430nm

色譜峰：

1：蔗糖，2：麥芽糖，3：鼠李糖，4：甘露糖，5：果糖，6：半乳糖，7：木糖，8：葡萄糖

除蔗糖為 1nmol 外，其余均為 100pmol.

圖17     條件：

色譜柱：Shim-pack ISA-07

        (250mm x4.0mm i.d.)

流  速：0.6mL/min

溫  度：65℃

流動相：A：100mM(鉀potassium)硼酸鹽緩沖液

        B：400mM(鉀potassium)硼酸鹽緩沖液

        梯度： from A to B 50min

檢  測：精氨酸柱后衍生法，熒光：Ex320nm，Em430nm

色譜峰：

1：蔗糖，2：纖維二糖(cellobiose)，3：麥芽糖，4：(loctose)，5：鼠李糖，6：核糖，

7：甘露糖，8：阿拉伯糖，9：半乳糖，10：異麥芽糖，11：木糖，12：葡萄糖