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一、自動進樣器常見故障
正確使用進樣器對分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性至關(guān)重要。進樣器損壞或零件不配套可引起峰變寬、樣品體積改變、滲漏或壓力升高。表1給出了一些常見的自動進樣器故障現(xiàn)象及解決辦法。
預(yù)防進樣器故障的措施包括:
①正確安裝進樣閥，保持清潔
②樣品必須是無固體顆粒的均勻液體，對于特別臟的樣品，必要時可經(jīng)0.45μm濾膜過濾，樣品應(yīng)選用合適溶劑溶解，與流動相互溶
③樣品瓶應(yīng)充分洗凈后使用，大小匹配樣品架，瓶蓋隔膜墊密封性能良好，便于針頭穿刺數(shù)次不滲漏，且無殘留樣品積聚隔膜墊處
④樣品支架安裝到位，避免針扎錯位
⑤進樣針應(yīng)經(jīng)常檢查維護，必要時更換，注意準(zhǔn)確設(shè)置針吸液高度，防止針頭彎曲
⑥編輯進樣器沖洗程序，每次進樣前和進樣后都應(yīng)沖洗進樣閥，清洗針外壁，防止交又污染
⑦建立系統(tǒng)期間核查檔案，定期對進樣器進行峰面積重復(fù)性考察，隨時維護校正。
表1常見的自動進樣器故障現(xiàn)象及解決方法
現(xiàn)象原因
排除方法
樣品進樣問題
(不進樣，出現(xiàn)不正常峰型)
1.進樣閥本身問題
2.針頭堵塞
3.注射器或樣品定量環(huán)裝置中有氣泡
4.從空樣品瓶中進樣
5.樣品瓶中樣品量少
6.樣品黏度太大
7.進樣口頂端螺母太緊(產(chǎn)生真空)
8.進樣器密封墊問題
1.清洗，維修或更換
2.疏通進樣針，必要時更換
3.排除氣泡
4.檢查樣品瓶位置，設(shè)置正確瓶號
5.增加樣品量或使用內(nèi)插管
6.減慢針抽樣速度或用合適溶劑稀釋
7.旋松
8.更換
樣品殘留
1.針頭清洗系統(tǒng)問題
2.進樣體積太大
1.更換清洗針頭的溶劑:更換被污染的砂芯反復(fù)多次清洗針；增加清洗針溶劑體積
2.減小進樣體積或更換大定量環(huán)
進樣體積不準(zhǔn)確
1.瓶中樣品量不夠
2.注射器泄漏
3.樣品黏度大
4.樣品瓶中產(chǎn)生真空
5.由泵流量不穩(wěn)，溫度波動等系統(tǒng)問題引起
6.計量泵不準(zhǔn)
1.保證樣品量足夠，調(diào)整好針吸液高度
2.修理，更換
3.稀釋樣品或減慢針抽取樣品速度進樣體積不準(zhǔn)確.
4.旋松瓶蓋，瓶中樣品不要裝太滿
5.檢查基線是否穩(wěn)定，出峰保留時間是否一致，排除系統(tǒng)問題
6.校準(zhǔn)計量泵，必要時更換
針頭彎曲
1.針頭從樣品瓶蓋中不能拔出
2.隔膜墊阻力太大
3.樣品架安裝不到位
1.去掉樣品瓶蓋，更換彎曲針頭
2.選用合適的隔膜墊
3.重新安裝樣品架
二、HPLC日常維護要點：脫氣、過濾、沖洗三大步驟
和其它分析儀器一樣，你若想讓HPLC很好地為你工作、得到可靠的數(shù)據(jù)，首先你要保養(yǎng)好它，使它處于一個良好的待機狀態(tài)，這樣你操作它進行分析時就可以比較順利地獲得理想的結(jié)果。而且良好規(guī)范的操作習(xí)慣可以延長儀器使用壽命。大家在學(xué)校或接受儀器公司培訓(xùn)的時候，老師或工程師會提出很多的操作注意事項。但要是總結(jié)歸納一下，重要的有三點：脫氣、過濾和沖洗。
脫氣
流動相脫氣可以避免HPLC系統(tǒng)出問題，從而順利得到理想的數(shù)據(jù)。HPLC系統(tǒng)內(nèi)是不希望有氣泡存在的。HPLC泵在輸送液體時要產(chǎn)生很大的力量，由于氣體的壓縮比與液體相比大的多，因而當(dāng)氣泡存在時，你將觀察到瞬間的流速降低和系統(tǒng)壓力下降。如果這個氣泡足夠大，液相泵將不能輸送任何溶劑，而且如果壓力低于預(yù)先設(shè)定的壓力低限，泵將停止工作。有些泵設(shè)計可以很好地排除氣泡，而也有一些泵設(shè)計當(dāng)氣泡存在時將停止運轉(zhuǎn)。
當(dāng)一個氣泡通過輸液泵時，由于系統(tǒng)壓力大，氣泡通常會溶解在流動相溶液中，隨流動相通過柱子。但是到達(dá)檢測器流通池時系統(tǒng)壓力又恢復(fù)到了大氣壓，因而氣泡可能在檢測器流通池中又顯現(xiàn)，在色譜圖上會出現(xiàn)不規(guī)律的毛刺。
紫外/可見光(UV/VIS)檢測器的液相色譜圖中的噪音毛刺通常是氣泡進入并通過流通池的征兆。此外，對于利用待測物質(zhì)在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)引起電流變化而進行檢測的電化學(xué)(EC)檢測器，對流動相中的溶解氧的存在也非常靈敏。此外，氣泡的存在有時還會導(dǎo)致保留時間不重現(xiàn)。
所以，必須注意消除流動相中的空氣，并且還應(yīng)避免空氣由管路(如PTFE管)滲透進流動相中。
常用的脫氣方法
1.吹氦脫氣法。利用氦氣在液體中溶解度比空氣低的特性，在0.1MPa壓力下，以約60mL/min流速通入流動相儲液容器中10～15min，可以很有效地從流動相中排除溶解的空氣，能排除接近80%的氧氣。采用一個高效分布式噴射流裝置，一體積的氦氣可從流動相中將等體積的幾乎全部氣體排除。這意味著1L氦氣通過1L流動相就可完成排氣這個工作。這種脫氣方法雖然好，但我們國內(nèi)氦氣價格較高，很少有實驗室采用此方法。
2.加熱回流法。此法的脫氣效果較好。在操作時要注意冷凝塔的冷卻效率，否則溶劑會丟失，混合流動相的比例會有變化。
3.抽真空脫氣法。此法可使用真空泵，降壓至0.05～0.07MPa即可除去溶解的氣體。但是由于真空脫氣會使混合溶劑組成發(fā)生變化，從而影響到實驗的重現(xiàn)性，因此多用于單溶劑體系的簡單分析。
4.超聲波脫氣法。將欲脫氣的流動相置于超聲波清洗器中，用超聲波震蕩10～20min。此法的脫氣效果差。
5.在線脫氣法。現(xiàn)在商品的HPLC儀器，均可配在線脫氣機。在線脫氣使用簡單，低故障，有效。建議購買儀器時一定要購買，有的公司是作為選購件，所以與儀器公司談配置時應(yīng)與公司確認(rèn)。
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過濾
任何顆粒物進入HPLC系統(tǒng)后都會在柱子入口端被篩板擋住，后的結(jié)果是將柱子堵塞，表現(xiàn)出的特征是系統(tǒng)壓力增加并使色譜峰變形。因此，要采取各種預(yù)防措施，包括操作步驟和商品儀器自身的各種過濾設(shè)計，努力防止或減少顆粒物進入HPLC系統(tǒng)中，從而延長儀器和色譜柱的使用壽命，并提高數(shù)據(jù)的可靠性。在HPLC系統(tǒng)中，顆粒物的主要來源有三個途徑：流動相、被測樣品和儀器系統(tǒng)部件的磨損物。
1、流動相
如果流動相均由高效液相色譜級溶劑組成，流動相沒有必要過濾。這是因為高效液相色譜級的有機溶劑，例如乙腈、甲醇等，在制造的工藝過程中都已經(jīng)過了0.2μm微孔濾膜過濾。同樣的，無論你是買的HPLC級的水還是在實驗室使用超純水凈化系統(tǒng)制備的水，后一步也是通過0.2μm微孔濾膜。然而，如果有任何一種緩沖液中加入了固體物，例如磷酸鹽，流動相過濾將是必要的一個步驟。雖然緩沖鹽可能是可溶解的、高純的，但它還是可能含有顆粒物質(zhì)，例如在蓋試劑瓶的塑料內(nèi)蓋時，塑料瓶蓋子與瓶口邊緣擠壓就會產(chǎn)生塑料顆粒。在這種情況下，添加的一種固體物可能*溶解了，但是少量雜質(zhì)顆粒存在于流動相中成為殘渣。
流動相通過0.45μm微孔濾膜過濾對于從流動相中除去所有顆粒物是一個有效方法。0.2μm微孔濾膜也可以用，但是它們就這個應(yīng)用而言并不比0.45μm微孔濾膜更有效，而且它的過濾速度會更慢，特別是當(dāng)實驗室使用的試劑和水的質(zhì)量不太好時。建議實驗室在編寫制定他們流動相制備標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOPs)時規(guī)定，可以借鑒上同類實驗室的規(guī)定，即：流動相制備僅采用HPLC級液體時不需要過濾，反之所有流動相組成在使用前必須過濾。
在連接儲液瓶和泵的輸液管的末端入口采用下沉式過濾器(常見材質(zhì)有熔融玻璃砂芯濾板和微孔金屬的兩種)也是很重要的。這個過濾器的規(guī)格為≥10μm的微孔物質(zhì)，所以它不能取代流動相過濾步驟，但是它能除去系統(tǒng)中的塵土并保證儲液瓶、輸液管使用的可靠性。
2、被測樣品
液相系統(tǒng)中的第二個顆粒物來源是被測樣品。一些實驗室在將他們的樣品放置在自動進樣器盤(或手動進樣)以前，所有樣品都先通過一個0.45μm針筒式過濾器過濾。這是一個有效除去被測樣品中顆粒物的方法。但是這個過程也有一點需要關(guān)注：你使用了針筒式過濾器就不可能100%得到通過過濾器的被測樣品，總會有或多或少的丟失。丟失來自這樣幾方面：過濾器濾膜的吸附、過濾器濾出的顆粒物上的吸附、針筒式濾膜過濾器與針筒連接處的滲漏等。如果有丟失，過濾后液體中被測物的含量或濃度與原基本樣液的含量或濃度還相同嗎？這個問題一般需要通過實驗確認(rèn)。確認(rèn)這步是要增加工作量和費用的。過濾器的使用是一種消耗，每個過濾器的價格從幾元到十幾元。但在做食品中殘留物分析時，由于基質(zhì)大多比較復(fù)雜，所以過濾這步已成為*的一步。在實際分析工作中，一般檢測每一組樣品會帶一個外標(biāo)、一個添加回收或是質(zhì)控樣品，所以，只要終檢測時得到的信噪比能滿足檢出限要求，可將這步視為系統(tǒng)誤差而忽略。
3、儀器系統(tǒng)部件的磨損物
后，在HPLC系統(tǒng)中顆粒物的另一個主要來源是輸液泵密封墊和進樣閥旋轉(zhuǎn)軸的磨損。關(guān)于輸液泵密封墊的磨損更換有兩種不同建議。
第1種建議認(rèn)為，在一般實驗室中輸液泵密封墊通常使用壽命為六個月到一年，因此建議半年或一年更換這些密封墊，實驗室應(yīng)基于上述觀點制定定期預(yù)防性維護計劃。該觀點認(rèn)為：與輸液泵密封墊顆粒堵塞柱子而更換新柱子的費用相比，更換密封墊的費用低些。一些輸液泵有玻璃砂芯或篩網(wǎng)，可在流路中濾掉從泵密封墊磨損下來的顆粒物，防止這些顆粒物隨流動相流至柱頭。若有這種裝置應(yīng)查閱輸液泵操作手冊，查看推薦的這種過濾器清洗或更換的間隔。
另一種建議則認(rèn)為，原裝密封墊的密封效果好，更換以后容易引起流動相滲漏。所以，只要不漏液就不要輕易更換密封墊。
沖洗
使HPLC系統(tǒng)良好運行的第三個要點是保持系統(tǒng)的清潔。你需要關(guān)注流動相流經(jīng)該系統(tǒng)的所有地方，對于這些地方經(jīng)常性的沖洗，將使你的系統(tǒng)保持在“Ready”狀態(tài)。
1、流動相儲液瓶
首先要經(jīng)常清洗流動相儲液瓶，或者每做一批新樣品更換一次流動相。一個臟的儲液瓶將會污染注入的流動相。建議儲液瓶中緩沖液使用時間不要超過一周，而有機溶劑使用時間不要超過一個月。也有人建議儲液瓶中保持用溶劑充滿，直到更換分析方法儲液瓶需更換新溶劑(流動相組成發(fā)生變化)時，將舊溶劑倒掉更換新溶劑，這樣勝于將溶劑用完。但這對于分析樣品量少的實驗室而言似乎有些浪費。儀器公司的工程師建議儲水瓶的水要天天換，每周瓶子還應(yīng)該用異丙醇清洗一次。有的實驗室則在水里加入0.1～1mM的甲酸抑制微生物的生長。這些做法看起來有些繁瑣，但卻能起到“磨刀不誤砍柴工”作用。
2、泵
接下來要沖洗的是泵。千萬不要一分析完沖幾分鐘后就停泵，特別是當(dāng)流動相中含有難揮發(fā)的緩沖液(如磷酸鹽)時。如果儀器不是連續(xù)使用，當(dāng)流動相蒸發(fā)時，難揮發(fā)物就會粘在活塞密封墊的表面，難揮發(fā)物將形成固形物沉淀。這是泵密封墊磨損和單向閥滲漏的主要原因之一。所以，無論使用長短，在停泵以前一定要用非緩沖液流動相沖洗泵在半個小時以上，要是流動相中有難揮發(fā)緩沖鹽則建議沖洗的時間應(yīng)該更長些。
3、自動進樣器
自動進樣器也要按規(guī)定清洗。現(xiàn)在的儀器多配有自動進樣器的沖洗液瓶，通常只要注意及時更換、補充沖洗液即可。自動進樣器用的洗滌液也要采用與流動相相同的方式處理，并根據(jù)溶劑的有效期和規(guī)定，清洗儲液瓶或更換洗滌液。現(xiàn)在的自動進樣器設(shè)置、操作都很簡單，如果時間允許(特別是利用夜間運行)，每次分析完后設(shè)置進1、2針純?nèi)軇?如甲醇、乙腈)，也是一個好做法。
4、色譜柱
對柱子的污染是隨使用時間而增加。通常表現(xiàn)是：運行走基線時在記錄的色譜圖中基線噪音增加，泵壓也增加。解決這個問題的有效方法就是在每一批樣品分析結(jié)束后或準(zhǔn)備卸下柱子時用大量的流動相沖洗柱子(例如，甲醇、乙腈和水)。用梯度沖洗效果更好，具體的比例要根據(jù)柱子的說明書和性質(zhì)而定。
5、檢測器
如果是正常使用，檢測器將依據(jù)其性質(zhì)并按照說明書規(guī)定進行洗。例如UV/VIS檢測器或FL檢測器，在對柱子和系統(tǒng)進行沖洗時也就一同對檢測器流通池中污染物進行了清洗。但是蒸發(fā)光檢測器或質(zhì)譜儀則需要按照說明書進行定期清洗。這些檢測器在使用時會有難揮發(fā)污染物沉積，如質(zhì)譜儀離子源的噴針、毛細(xì)管、錐孔板、預(yù)四極等部件，因而需要定期清洗。而且對聯(lián)有這些檢測器的系統(tǒng)沖洗時，建議與這些檢測器斷開，以減少對檢測器的污染。
總之，實驗室日常使用的液相色譜儀要是能認(rèn)真做好這三項工作——脫氣、過濾和沖洗，你的儀器可以得到良好的預(yù)防性維護，使用時就會感到比較順手。當(dāng)然，在實際操作時遇到的問題并沒有這么簡單，但這三個良好習(xí)慣將是正確操作、使用HPLC系統(tǒng)的基礎(chǔ)。
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