開學季又到了實驗汪又要去“搬磚”了
如何優雅的搬磚還不用求助師兄師姐

當然是關注“小奧課堂”欄目啦

今天小奧為各位介紹的
是一篇干貨滿滿的 
噬菌體展示方法實踐手冊 
“噬菌體的擴增與定量”

 這是一份難得的學霸筆記
請收好（收藏）！ 

Part 1

雜交瘤、單細胞克隆和噬菌體展示技術是抗體發現的三種主流技術，其中噬菌體展示技術作為諾獎級別的技術，在生物創新醫藥研發過程中有著十分重要的作用，極大的加快了抗體類藥物研發的進程。噬菌體展示技術不僅在新的抗體和多肽的發現及優化過程中有著核心的作用，還能和傳統的動物免疫技術相結合，與納米抗體、全人源轉基因小鼠發現平臺進行有效對接，能夠廣泛用于抗體、抗體偶聯藥物和CAR-T/TCR-T等領域。本文將針對噬菌體展示技術的噬菌體增殖和擴增實驗細節進行探討、分享具體實驗過程的經驗，以其原理為根本來指導實驗過程，以精益求精的實驗過程，增加噬菌體展示技術在抗體發現過程中的成功率。

Part 2 

——噬菌體文庫 
 擴增及展示的基本原理 | 

現在普遍應用的噬菌體展示抗體片段的體系稱之為“3+3體系”（3為噬菌體的p3衣殼蛋白）；3+3代表著p3衣殼蛋白有兩個來源：

• 噬菌粒（phagemid）
• M13KO7輔助噬菌體(Helper Phage）

菌粒（phagemid）上的p3蛋白融合了抗體片段的基因，是文庫多樣性的關鍵；輔助噬菌體(Helper Phage)上的p3蛋白為噬菌體天然的p3蛋白。
*噬菌粒是一種比較小的質粒載體，在大腸桿菌感受態中有較高的轉化效率，并且能夠在大腸桿菌中擴增。

含有噬菌粒的大腸桿菌被輔助噬菌體(Helper Phage)感染后，會利用大腸桿菌的酶系統、原料和能量進行擴增,終包含噬菌粒的噬菌體從大腸桿菌釋放出來，該子代噬菌體的p3衣殼蛋白會展示抗體片段。

Part 3

 ——在噬菌體擴增過程中 
 遇到的難題和對應的解決方案 | 

噬菌體的建庫過程實際上是抗體片段基因多樣性的傳遞過程：
從血樣中抗體基因的多樣性傳遞到噬菌粒的過程，是噬菌粒文庫構建的內容；
從噬菌粒的多樣性傳遞到含有噬菌粒的大腸桿菌的多樣性，是噬菌粒質粒電轉大腸桿菌的內容；
從含有噬菌粒的大腸桿菌的多樣性傳遞到噬菌體的多樣性則是噬菌體擴增的內容，也是本文實驗經驗關注的問題。

噬菌體的擴增終目的是將噬菌粒中單一拷貝的抗體片段基因通過噬菌體的擴增過程變成10-100個拷貝，且這些拷貝基因能夠在噬菌體表面的p3蛋白上展示出抗體蛋白片段。

在噬菌體的擴增過程要使得文庫的多樣性得以保持和傳遞，需根據文庫的初始大小確定在擴增過程中含有噬菌粒的大腸桿菌的數目和體積，對應加入的輔助噬菌體的多少進行有效感染，以及擴增后加入多少含有噬菌粒的噬菌體進行淘選等需要一一計算評估的問題，不同文庫大小的噬菌體庫在擴增過程中需要的擴增體積是不一樣的。一份固化的實驗方案很有可能會導致文庫多樣性的丟失。
要弄清楚這些問題，首先要具備以下幾點基礎的前置知識：

（??以下內容全部劃重點！?。。?/span>

1. TG1大腸桿菌在OD600的讀數：1OD代表的菌濃度為1e9個/ml。
2. 噬菌體/輔助噬菌體在TG1處于對數生長期時有比較好的感染效率，TG1處于對數生長期的OD600值在0.4-0.8。
3. TG1在對數生長期的生長速度是20分鐘一代，需要密切關注TG1的生長，及時取菌進行實驗。4. 輔助噬菌體和TG1的比值MOI在20：1時能夠保證所有TG1被感染上。
5. 含有噬菌粒的噬菌體能夠感染正常的TG1大腸桿菌，并將噬菌粒留在TG1中并隨著TG1的擴增進行擴增，在無輔助噬菌體的情況下無噬菌體的擴增。
6. 噬菌粒質粒含有青霉素抗性，輔助噬菌體含有卡那霉素抗性。
7. 含有噬菌粒的噬菌體可以通過感染正常的TG1，梯度稀釋涂青霉素抗性的瓊脂板進行滴度測定。8. 3+3模式下含有噬菌粒的噬菌體展示出p3融合抗體片段蛋白的效率比較低，只有5%-10%,在進行淘選時，加入的噬菌體的滴度應是文庫多樣性的100倍以上。
還有一個比較關鍵的問題是噬菌體作為一種病毒，很容易以氣溶膠的形式擴散到空氣中污染實驗室的環境，從而感染F因子陽性的大腸桿菌。 （心疼一下生物汪，冒著生命危險搬磚啊?。?/s>
在噬菌體展示的相關實驗需要在相對封閉的實驗室進行以避免噬菌體對于大腸桿菌的污染，特別是在培養正常的TG1大腸桿菌時。噬菌體的滅活方式通常是紫外照射半小時以上。
（合格的生物汪，是個莫得感情的病毒殺手?。?/s>

Part 4 

——噬菌體擴增和定量 
 具體實驗過程的分享 | 

以下是以一個文庫大小為1E9的噬菌體文庫進行擴增的實驗方案。
*如果文庫過大或者過小，可依比例增減擴增體積。
 

Day 1
（搬磚禿頭的一天）

1. 取含有噬菌粒的TG1菌種1ml (菌數目為1E10)加入含有100ml 2xYT-GA培養基250ml搖瓶中，使用奧豪斯搖床37度220rpm搖菌搖床至OD600為約0.5。2. 取OD600為約0.5的菌液20ml (菌數目為1E10),按照MOI為20：1加入pfu為2E11的輔助噬菌體M13 K07，37度220rpm振蕩半小時進行感染。3. 取感染后菌液到50ml離心管使用奧豪斯離心機5816R 3200g離心10分鐘，去除培養基，以除去培養基中的葡萄糖對噬菌粒中p3蛋白融合了抗體片段蛋白表達的抑制。4. 用2xYT-AK培養基重懸菌團，將培養基加至400ml，用1L搖瓶在30度220rpm過夜搖菌。

Day 2
（搬磚禿頭的第二天）

5. 將400ml菌液均分至大的離心瓶中，使用奧豪斯離心機5816R 10000g離心10分鐘，取上清，10000g再次離心10分鐘，去除殘留的菌體碎片。6. 取90ml PEG溶液加入400ml上清液中，在4℃孵育1小時并伴隨著柔和的振蕩，然后使用帶低溫控制功能的奧豪斯離心機5816R 4℃10000g離心1小時。7. 去上清，用10mlPBS重懸噬菌體后，加入2.5ml PEG溶液再次沉淀.8. 冰上孵育20分鐘，然后使用帶低溫控制功能的奧豪斯離心機5816R 4℃ 10000g離心半小時。9. 去上清液，用吸水紙吸干殘留的PEG溶液，加入1-2ml的PBS重懸噬菌體，進行滴度測定。

滴度測定：
1. 在分隔的實驗室，取正常的TG1大腸桿菌加入2xYT的培養基中，使用奧豪斯搖床搖菌至OD600值為0.5，如未能及時使用，可放入4℃ 2小時以備用。
2. 將步驟9中擴增噬菌體原液用PBS稀釋1E5-1E7倍。
3. 取10ul噬菌體稀釋液加入490ul OD600為0.5的TG1大腸桿菌中，使用奧豪斯搖床 37℃ 220rpm振蕩半小時進行感染。
4. 取感染液50ul均勻涂抹在含有2xYT-GA的瓊脂板中，晾干后放入37℃培養箱過夜。并將未感染TG1大腸桿菌涂抹瓊脂板作為陰性對照。
 

Day 3
（搬磚禿頭的第三天）

5. 數2xYT-GA的瓊脂板中的克隆數，根據稀釋倍數計算擴增噬菌體的滴度
噬菌體滴度(pfu/ml)=（克隆數*10*50/10ul）*稀釋倍數
6. 取1E11-1E12的噬菌體用于淘選。

試劑配方：
2xYT培養基：Yeast Extract 10.0 g/L+Tryptone 16.0 g/L+NaCl 5.0 g/L
2xYT-GA培養基: 2xYT培養基+100 μg/ml 青霉素+ 1% （W/V）葡萄糖
2xYT-AK培養基：2xYT培養基+100 μg/ml 青霉素+50 μg/ml卡那霉素
PEG溶液：20% (w/v) PEG 6000, 2.5 M NaCl
 

Part 5
儀器推薦：

（做科研民工的每一天都不孤單，因為有小奧陪伴）

噬菌體作為一種病毒，很容易以氣溶膠的形式擴散到空氣中污染實驗室的環境，需要封閉的實驗室，實驗室所有的儀器需單獨使用。
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此外，噬菌體展示實驗的過程中會有不同體積、不同轉速和需要4℃條件的離心步驟，如果以多
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