產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

試劑盒內(nèi)含兩種熒光染料DMAO和EthD-III，可分別將活細(xì)菌和死細(xì)菌染上綠色和紅色。其中DMAO是一種綠色核酸熒光染料，可染色活細(xì)菌和死細(xì)菌。EthD-III是一種紅色核酸熒光染料，僅染色細(xì)胞膜受損的死細(xì)菌。將DMAO和EthD-III混合使用染色時(shí)具有完整細(xì)胞膜的細(xì)菌呈現(xiàn)綠色，而具有受損細(xì)胞膜的細(xì)菌呈現(xiàn)綠色和紅色。結(jié)果可以通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀來分析，適用于大多數(shù)細(xì)菌類型。

細(xì)菌活力的常見標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)菌在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中繁殖的能力，稱為生長(zhǎng)測(cè)定。該試劑盒通常與在液體或固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果有著很好的一致性。在某些條件下，膜損傷的細(xì)菌可能會(huì)在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中恢復(fù)并繁殖，而這種細(xì)菌在該測(cè)定中可能會(huì)被認(rèn)為死亡。相反，一些具有完整膜的細(xì)菌可能無法在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中繁殖，但這些細(xì)菌在該測(cè)定中可能被認(rèn)為是活的。因此，如果發(fā)現(xiàn)該檢測(cè)和細(xì)菌生長(zhǎng)測(cè)定之間有相當(dāng)大的差異，應(yīng)該考慮上述的可能性。

光譜特性DMAO：Ex/Em=503/530nm（withNDA）； EthD-III：Ex/Em=530/620nm（withNDA）

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存方法

冰袋（wet ice）運(yùn)輸。儲(chǔ)存于 4ºC，至少可以儲(chǔ)存6個(gè)月。

注意事項(xiàng)

操作時(shí)請(qǐng)采取防護(hù)措施，穿防護(hù)服、戴一次性手套等。

使用方法

活、死細(xì)菌樣品對(duì)照制備

1. 在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 mL的細(xì)菌至晚期對(duì)數(shù)期。

2. 在EP管中準(zhǔn)備兩份1mL的細(xì)菌液，并在5,000-10,000g條件下離心10-15 min。

3. 去除上清液，在其中一支EP管中加入0.3mL的0.85% NaCl重懸細(xì)菌，在另一管中加入1 mL的0.85% NaCl重懸細(xì)菌。

4. 在含有0.3 mL的0.85% NaCl的管中加入0.7 mL異丙醇，充分混合（終濃度為70% 的異丙醇）用以制備死細(xì)菌樣品。

5. 將兩種樣品在室溫下孵育1 h，每15 min混合一次。

6. 兩種樣品在5,000-10,000g條件下離心10-15 min。

7. 去除上清，在兩種樣品中加入1 mL的0.85% NaCl重懸細(xì)菌，并如步驟6再次離心。

8. 使用分光光度計(jì)測(cè)定兩種菌懸液在670 nm處的吸光值（OD670）。

9. 將兩種菌懸液（活的和死亡的）密度調(diào)整到108個(gè)細(xì)菌/ mL（OD670≈0.3），然后用0.85% 的NaCl以1：100稀釋，使終密度為106個(gè)細(xì)菌/ mL。

10. 如下所示混合兩種菌懸液以獲得所需的活細(xì)胞：死細(xì)胞比率。

表1. 活、死菌懸液按一定體積混合以達(dá)到所需的活細(xì)胞、死細(xì)胞比例

熒光顯微鏡的染色方法

1. 將1體積的DMAO和2體積的EthD-III在微量離心管中混合，充分混合后加入8體積的0.85% NaCl溶液以得到100×染料溶液。

2. 每100 μL菌懸液，加1 μL的100×染料溶液。

3. 充分混合，室溫下在黑暗中孵育15 min。

4. 取5 μL染色后的菌懸液滴在帶有18 mm方形蓋玻片的載玻片上。

5. 在熒光顯微鏡下觀察。活細(xì)菌和死細(xì)菌的熒光可以在任何標(biāo)準(zhǔn)的FITC長(zhǎng)效過濾器下同時(shí)觀察到。或者，活的（綠色熒光）和死的（紅色熒光）細(xì)菌可以分別用FITC和Cy3（或TexasRed）通道觀察。

注意：
1) 在對(duì)細(xì)菌染色之前，必須注意除去生長(zhǎng)介質(zhì)的殘留。核酸和其他培養(yǎng)基組分可以以某種方式結(jié)合DMAO和EthD-III染料，導(dǎo)致不可接受的染色變化。簡(jiǎn)單的洗滌步驟通常足以從細(xì)菌懸浮液中除去干擾介質(zhì)組分。不建議使用磷酸鹽緩沖液，因?yàn)樗鼈儠?huì)降低染色效率。
2) 在開始正式實(shí)驗(yàn)前應(yīng)調(diào)節(jié)染料濃度來使DMAO標(biāo)記活細(xì)菌、使EthD-III標(biāo)記死細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分。*濃度可能因細(xì)菌菌株的不同而異。一般使用能夠提供充足信號(hào)的低染料濃度。以下條件針對(duì)大腸桿菌活/死細(xì)胞染色進(jìn)行了優(yōu)化。

細(xì)胞流式的染色方法

實(shí)驗(yàn)開始前，請(qǐng)閱讀熒光顯微鏡染色步驟下的注意事項(xiàng)。

1. 根據(jù)表1，在EP管中加入11種不同比例的活細(xì)菌和死細(xì)菌。11種樣品中每種的體積1 mL。

2. 將12 μL的DMAO儲(chǔ)備溶液與24 μL的EthD-III儲(chǔ)備液在微量離心管中混合。11個(gè)樣品中的每個(gè)加入3 μL的混合染料，通過上下吹打幾次*混合。（注意：需要準(zhǔn)備另外的對(duì)照細(xì)菌樣品用于單獨(dú)的DMAO和單獨(dú)的EthD-III染色）

3. 室溫下在黑暗中孵育15 min。

4. 使用流式細(xì)胞儀分析每個(gè)樣品，使用DMAO陽性細(xì)胞的FITC通道和EthD-III陽性細(xì)胞的PI或PE通道。