一、工作原理
分子的紫外可見吸收光譜是由于分子中的某些基團吸收了紫外可見輻射光后，發(fā)生了電子能級躍遷而產(chǎn)生的吸收光譜。由于各種物質(zhì)具有各自不同的分子、原子和不同的分子空間結(jié)構(gòu)，其吸收光能量的情況也就不會相同，因此，每種物質(zhì)就有其*的、固定的吸收光譜曲線，可根據(jù)吸收光譜上的某些特征波長處的吸光度的高低判別或測定該物質(zhì)的含量，這就是分光光度定性和定量分析的基礎(chǔ)。
分光光度分析就是根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜研究物質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)和物質(zhì)間相互作用的有效手段。它是帶狀光譜，反映了分子中某些基團的信息。可以用標準光圖譜再結(jié)合其它手段進行定性分析。
根據(jù)Lambert-Beer定律說明光的吸收與吸收層厚度成正比，比耳定律說明光的吸收與溶液濃度成正比；如果同時考慮吸收層厚度和溶液濃度對光吸收率的影響，即得朗伯-比耳定律。即A=εbc，(A為吸光度，ε為摩爾吸光系數(shù)，b為液池厚度，c為溶液濃度)就可以對溶液進行定量分析。
將分析樣品和標準樣品以相同濃度配制在同一溶劑中，在同一條件下分別測定紫外可見吸收光譜。若兩者是同一物質(zhì)，則兩者的光譜圖應*一致。如果沒有標樣，也可以和現(xiàn)成的標準譜圖對照進行比較。這種方法要求儀器準確，精密度高，且測定條件要相同。
實驗證明，不同的極性溶劑產(chǎn)生氫鍵的強度也不同，這可以利用紫外光譜來判斷化合物在不同溶劑中氫鍵強度，以確定選擇哪一種溶劑。
二、紫外可見分光光度計的工作環(huán)境
1）分光光度計安放在干燥的房間內(nèi)，使用溫度為5-35℃，相對濕度不超過85%
2）儀器應放置在堅固平穩(wěn)的工作臺上，且避免強烈的震動或持續(xù)的震動
3）室內(nèi)照明不宜太強，且應避免直射日光的照射
4）電扇不宜直接向儀器吹風，以防止光源燈因發(fā)光不穩(wěn)定而影響儀器的正常使用
5）盡量遠離高強度的磁場、電場及發(fā)生高頻波的電氣設備
6）避免在有硫化氫等腐蝕性氣體的場所使用
二、減除紫外可見分光光度計因素誤差的措施
1、減除入射光束單色性不純的影響
各種不同的分光光度分析儀器除了本身的質(zhì)量決定其單色光的純度不同外，使用或操作也會影響單色光的純度，例如對同一臺分光光度計，由于出射狹縫調(diào)節(jié)不當就會使單色光純度差。因此除了應該根據(jù)分析的要求選擇適當?shù)膬x器外，還必須正確的使用儀器。
2、減除雜散光的影響
雜散光的主要來源是儀器的光學元件保護不好，例如透鏡或反射鏡上有塵埃或指紋印。分光光度計光學系統(tǒng)的暗箱中的黑體被劃傷或脫落，在操作時樣品室蓋未蓋好等。因此要消除雜散光應注意以下幾點。
1）做好分光光度計（特別是光學系統(tǒng)）的防潮和防霉工作。不允許用手或其他硬物摸碰光學元件和暗箱的黑體
2）保護好吸收池架，并應經(jīng)常保持其清潔和干燥
3）測定時，必須蓋好樣品室蓋
3、減除吸收池誤差
吸收池的質(zhì)量（主要是精度）不好或使用不當都會給測定結(jié)果帶來誤差。即使是同一組的數(shù)個同規(guī)格的吸收池，也不能保證其光程長度相等，只是其誤差在一定的范圍之內(nèi)。為了減除由此而產(chǎn)生的誤差，使用時應對吸收池進行校正。