◆背景

　　此方法用于分析檢測果汁成品或原料。此文件細節性地描述了嗜熱嗜酸菌（以下縮寫為TAB）的定量檢測和其確認測試。此文件含有關于TAB的定義，描述和其他的相關信息。

◆原理

　　在濃縮果汁，特定甜味劑和一些飲料中，TAB（脂環酸芽孢桿菌）主要以孢子的形式存在。這些孢子的活性往往在高溫殺菌，并且有合適的生長環境的條件下增長。TAB不會在冷飲中生長。如果環境允許，TAB會生成一種名為愈創木酚的化合物。此化合物會給產品和原料帶來一種藥的味道。基于此藥味，樣品被認為是腐壞了。

◆原料和標準品

      a．酵母提取物（212759，BD）

      b．葡萄糖（215530，BD）

      c．可溶性淀粉（217820，BD）

      d．瓊脂（214530）

      e．愈創木酚測試套裝

◆儀器設備

      a．水浴鍋

      b．培養箱

◆實驗過程

      a．培養基（YSG）配制

      i．溶液A：在1L燒杯中稱量2g酵母提取物，1g葡萄糖和2g可溶性淀粉。加入500mL去離子水溶解。加入適量1N的鹽酸或硫酸，使pH調整至3.7±0.1。

      ii．溶液B：取一個新的1L的燒杯。稱量15g瓊脂并加入500mL去離子水加熱溶解。

      iii．在121°C下蒸汽滅菌15分鐘。

      iv．當溶液A和B的溫度都降至47±0.2°C時，在無菌條件下將溶液A倒入溶液B中混合。

      v．在培養皿中倒入15至20mL配置完成的培養基（YSG）并使其凝固。將澆好的培養皿放入冰箱中存放。保質期為一個月。

      b．樣品準備（熱擊）

      i．在試管中準備9mL的無菌水，在無菌條件下加入1mL濃縮果汁并混勻。

      ii．將試管置于80°C水浴鍋中熱擊。當樣品溫度到達80±0.2°C時計時10分鐘。然后快速降溫至室溫。

      iii．如果樣品為單倍果汁，則無需稀釋。

      c．樣品分析方法

      i．涂布法（用于不可過濾的樣品）：

         1．向固體YSG培養基中加入1mL熱擊過的稀釋樣品（單倍果汁無需稀釋，直接取1mL樣品）。將樣品均勻涂抹在培養基表層。

        2．將平板正放于45±2°C培養箱中培養一天。

        3．一天后倒置平板并繼續培養4天。

      ii．膜過濾法（用于可過濾樣品）：

        1．在50mL無菌水中加入熱擊過的稀釋樣品（單倍果汁無需稀釋，直接取10mL樣品加入）。混勻后用0.45µm濾膜過濾。

        2．在無菌條件下將濾膜轉移至固體YSG培養基上。

        3．倒置平板，在45±2°C培養箱中培養5天。

      d．結果分析

        i．如果樣品中菌落計數小于原料標準要求，用愈創木酚測試套裝進一步檢測會有無產生鄰甲氧基苯酚的微生物。如果菌落計數大于原料標準要求，則直接認定為不合格樣品。

        ii．陽性平板應通過顯微鏡鏡檢來確定脂環酸芽孢桿菌的存在。

        iii．每一套測試樣品需要有控制平板做比對。包括空氣，陽性菌對比，YSG培養基和樣品所使用的無菌水。

      e．愈創木酚測試套裝

        i．用接種環取10 µL不含孢子的新鮮菌落，懸浮于含有“Va-YSG 試劑 (2mL)”的試管中（≥1×108cfu/mL）。

        ii．在45±1°C下培養3小時或過夜。

        iii．加入1mL鄰甲氧基苯酚測試套裝試劑1。

        iv．加入20µL鄰甲氧基苯酚測試套裝試劑2。

        v．加入20µL鄰甲氧基苯酚測試套裝試劑3。

        vi．混勻并放置5－10分鐘。

        vii．觀察溶液的顏色變化。在10分鐘內讀取數據。

        viii．陽性控制：取2mL純凈水和100µL陽性控制并混合。重復步驟iii－vii。

        ix．空白：取新的“Va-YSG”試劑并重復步驟ii－vii。

◆質量控制檢測

      a．這項測試需要含有少量TAB陽性菌的可過濾果汁樣品作為過程檢查。

      b．向10mL離心管中加入1mL陽性樣品（濃縮）。加入9mL無菌水或緩沖劑。

      c．80±2°C熱擊10分鐘。

      d．取1mL樣品至50mL無菌水中混合。

      e．過濾并把陽性控制儲藏在冷凍（-18°C）條件下。

產品信息鏈接：愈創木酚測試套裝