1、本試劑盒貨號(hào)：D3030L1411如何保存？

    室溫保存，無(wú)需低溫保存。

2、本試本劑盒貨號(hào)：D3030L1411能否分離純化200-1000nm直徑的囊泡嗎？

    不能，本試劑盒不能用于直徑大于200nm囊泡的分離。

3、本試劑盒貨號(hào)：D3030L1411適用于哪些種類樣品中的外泌體提取？

    除細(xì)胞上清液外，本試劑盒還可用于尿液及其他低密度體液（如腦脊液、腹水、羊水、乳汁、唾液等）的外泌體提取。

4、本試劑盒貨號(hào)：D3030L1411提取過(guò)程會(huì)用到哪些儀器和耗材？

    低溫高速離心機(jī)、渦旋振蕩器（Vortex）、水浴鍋、移液器、離心管（1.5mL、50mL）。

5、樣品在提取外泌體之前是否可以低溫保存？

     可以。長(zhǎng)期請(qǐng)保存于-80℃，無(wú)須加凍存液；短期（1-2天內(nèi)）則保存于4℃即可。

6、粘度過(guò)大的樣品如何處理？

    如果樣品粘度過(guò)大時(shí)（因細(xì)胞分泌物較多所致），可將樣品用1×PBS緩沖液進(jìn)行等體積稀釋，混勻稀釋后的樣品再使用本試劑盒提取外泌體。

7、培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，如何去除血清來(lái)源的外泌體？

    多數(shù)情況下，細(xì)胞在體外培時(shí)養(yǎng)需要血清，而血清中一般都含有外泌體，為避免血清對(duì)細(xì)胞外泌體的污染，可采用以下兩種方法：

（1）  將細(xì)胞培養(yǎng)用的血清通過(guò)1×105g超速離心10h以去除血清外泌體；

（2）  選擇無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

8、無(wú)外泌體血清培養(yǎng)基（或者無(wú)血清培養(yǎng)基）在什么時(shí)候使用？

    細(xì)胞在正常含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定的時(shí)間后，細(xì)胞融合度約為60%-70%時(shí)，移去原有含血清的培養(yǎng)基，換成新鮮的無(wú)外泌體血清培養(yǎng)基（或者無(wú)血清培養(yǎng)基），繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，細(xì)胞融合度達(dá)到80%-95%左右時(shí)收取上清,該上清液即可用于提取外泌體。

9、細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的死細(xì)胞是否會(huì)影響外泌體的提取？

    會(huì)的。在收獲細(xì)胞時(shí)，應(yīng)確定死亡細(xì)胞占比不超過(guò)5%。細(xì)胞凋亡/死亡過(guò)程中會(huì)釋放大量大小不等的囊泡，它們?cè)谕饷隗w的提取純化過(guò)程中會(huì)污染活細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體，同時(shí)有可能會(huì)堵塞EPF純化柱。

10、準(zhǔn)備做細(xì)胞外泌體Small RNA的NGS測(cè)序，初始樣品量需要準(zhǔn)備多少？

    普通腫瘤細(xì)胞系推薦使用40mL以上的初始樣品量。由于某些細(xì)胞（如懸浮細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等）中外泌體含量比較低，建議先通過(guò)10kD超濾柱濃縮，準(zhǔn)備40mL以上的濃縮液再使用本試劑盒提取外泌體。

11、加了ECS液離心之后無(wú)沉淀，這個(gè)現(xiàn)象正常嗎？

    由于某些細(xì)胞（如懸浮細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等）中外泌體含量比較低，加了ECS液離心之后肉眼可能無(wú)法觀察到沉淀，在重懸時(shí)使用PBS液朝離心管離心外側(cè)的內(nèi)壁反復(fù)吹打洗脫即可（避免劇烈吹打）。針對(duì)提取后的外泌體先進(jìn)行NTA粒徑檢測(cè)或BCA蛋白定量檢測(cè)，再?zèng)Q定是否進(jìn)行后繼實(shí)驗(yàn)。

12、在純化過(guò)程中，EPF柱為什么會(huì)出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象？

      該現(xiàn)象有可能是因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)產(chǎn)生很多細(xì)胞碎片(樣品離心預(yù)處理時(shí)不充分，仍有細(xì)胞碎片殘留)，建議細(xì)胞培養(yǎng)24-48h左右收集上清液。

13、EPF柱是否可以多次使用？

    不能重復(fù)使用。過(guò)量的樣品會(huì)超出純化柱的使用極限，影響分離效果。

14、外泌體如何保存？

    純化后的外泌體可于4℃保存不超過(guò)一周，-80℃條件下可長(zhǎng)期保存。

15、如何鑒定提取的外泌體？

    通常使用透射電鏡檢測(cè)（形態(tài)）、粒徑檢測(cè)（大小）、Western blot檢測(cè)等方法鑒定提取的外泌體。在進(jìn)行Western blot檢測(cè)時(shí)，通常檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白（CD63、CD9、CD81、TSG101等）。

16、提取的外泌體進(jìn)行Western blot前是否需要加入RIPA試劑裂解？

    需要，一般按照1:1的比例加入RIPA試劑。

17、進(jìn)行外泌體Western blot鑒定時(shí)有無(wú)內(nèi)參蛋白可供選擇？

      無(wú)，該檢測(cè)屬于定性檢測(cè)。                              

18、組織細(xì)胞外泌體如何提取？

    無(wú)菌環(huán)境下將組織剪成小塊（越小越好），然后在無(wú)血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h；將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，于4℃以3000g離心20 min去除培養(yǎng)液中雜質(zhì)和細(xì)胞碎片，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中；先使用0.45μm濾器過(guò)濾上清液，接著使用0.2μm濾器過(guò)濾上清液，再按照本試劑盒說(shuō)明書提取外泌體。